堿性木聚糖酶在畢赤酵母的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究*

熊科，楊玉煥，閆子祥，王曉玲，李秀婷

1(北京市質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)2(北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京，100048)3(北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)

植物纖維是自然界中最主要的可再生有機(jī)資源。在世界能源日益短缺的情況下，這些能源正越來越受到重視。植物纖維的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中半纖維素約占植物干重的35%，是自然界中僅次于纖維素含量的可再生資源。木聚糖是植物細(xì)胞壁中的主要結(jié)構(gòu)非淀粉多糖，含量?jī)H次于纖維素，約占細(xì)胞干重的7% ～35%［1］。

木聚糖酶(Xylanase)是一類水解木聚糖主鏈內(nèi)部β-1，4木糖苷鍵的糖苷水解酶，多數(shù)作用于木聚糖的無側(cè)枝區(qū)段，產(chǎn)生低聚糖或帶有側(cè)枝的寡聚糖。糖苷水解酶根據(jù)催化區(qū)的保守氨基酸和疏水區(qū)的不同分為58個(gè)族［2］，大部分木聚糖酶屬于F/10或G/11族，其中 F/10族的木聚糖酶分子量大多大于30 kDa，結(jié)構(gòu)多樣，除了催化區(qū)域一般還含有多種非催化區(qū)域如纖維素結(jié)合域(CBD)等，能較快地水解木聚糖生成低聚木糖和木糖。G/11族木聚糖酶結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，水解木聚糖的速度慢，產(chǎn)物多為木寡糖［3］。不同族的木聚糖酶在結(jié)構(gòu)和分子量上具有很大的區(qū)別，但是同一族的木聚糖酶則在氨基酸序列上具有較高的保守性，且催化特性相近。多數(shù)的木聚糖酶不但能催化木聚糖水解，還能水解纖維素，具有纖維素酶活，稱之為交叉活性［4］。木聚糖酶在諸多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，微生物發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶是目前最普遍的一種方法，但通過天然菌株發(fā)酵有一系列的弊端。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用工程菌株表達(dá)木聚糖酶成為解決這些弊端的有效手段。近些年畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展尤為迅速，為表達(dá)木聚糖酶提供了良好的基礎(chǔ)，如ZHANG［5］等從瓶霉菌(Phialo-phora sp.)G5中克隆出內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因 xyn10G5，并使其在畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)，經(jīng)過純化重組的XYN10G5的最適作用溫度和pH值分別為70℃和4.0，在pH值3.0～9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定(＞70%的最大活性)，70℃熱穩(wěn)定(保留90%的最初酶活性1 h)。

本研究對(duì)1株畢赤酵母工程菌產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)重組木聚糖酶的性質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)的研究，旨在為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及培養(yǎng)基

蛋白marker(美國Thermo);櫸木木聚糖、樺木木聚糖、燕麥木聚糖、殼聚糖(美國Sigma);玉米芯水溶性木聚糖、玉米芯水不溶性木聚糖、棉子殼木聚糖、甘蔗渣木聚糖、豆稈木聚糖、麩皮木聚糖為實(shí)驗(yàn)室自制。

CAPS、CHES、MES 和 MOPS，考馬斯亮藍(lán) R-250，四甲基己二胺(TEMED)(美國Biomol);DEAE Sepharose Fast Flow(美國 GE);YNB(美國BD);Endo H酶(美國NEB)。質(zhì)粒中提試劑盒，膠回收試劑盒(美國OMEGA);卡那霉素(美國 AMRESCO);LaTaq DNA(with GC buffer)，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、Bgl II，T4DNA連接酶(日本TAKARA);瓊脂糖(英國OXOID);BMMY培養(yǎng)基;BMGY培養(yǎng)基;MD培養(yǎng)基;木聚糖-剛果紅篩選平板。

其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌種

GS115畢赤酵母宿主菌(本實(shí)驗(yàn)室保存);pPIC9K畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒(Invitrogen公司);pPIC9K-xynAeSC(實(shí)驗(yàn)構(gòu)建);重組畢赤酵母菌株GS115－3－20。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒pPIC9K-xynAeSC的構(gòu)建

根據(jù)pPIC9K載體上的限制酶位點(diǎn)和xynAeSC序列，選擇EcoRⅠ和Not I兩個(gè)限制酶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物。引物序列如表1所示。

表1 含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)的引物序列Table 1 Primers with restriction sites

分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I，Not I雙酶切表達(dá)載體pPIC9K和含EcoRⅠ、Not I酶切位點(diǎn)基因片段xynAeSC，37℃反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收大小合適的片段。用DNA連接酶連接帶有粘性末端的基因片段和線性化的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K(摩爾比3∶l)，16℃連接12 h，完成表達(dá)載體pPIC9K-xynAeSC的構(gòu)建。重組表達(dá)載體pPIC9K-xynAeSC用Bgl II酶線性化后，用電穿孔法將其導(dǎo)入畢赤酵母，吸取一定體積的轉(zhuǎn)化液涂布RBD平板，30℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法提取重組子的基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。堿性木聚糖酶基因xynAeSC的常規(guī)誘導(dǎo)表達(dá)依據(jù)畢赤酵母多拷貝表達(dá)試劑盒(Mutil-Copy Pichia Expression Kit，Invitrogen公司)的操作手冊(cè)。

1.3.2 木聚糖酶測(cè)定的方法

木聚糖酶活力測(cè)定參照DNS法。

1.3.3 蛋白含量測(cè)定的方法

參考Lowry］的經(jīng)典方法，以牛血清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE按照Laemmli［6］介紹的方法進(jìn)行。分離膠質(zhì)量濃度125 g/L，濃縮膠45 g/L，考馬斯亮蘭染色顯示蛋白帶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白與樣品在同一條件下進(jìn)行電泳。

1.3.5 重組酶(XynAeSC)純化

1.3.5.1 粗酶液的鹽析

硫酸銨50% ～80%梯度鹽析得粗酶液，8 000×g，10 min 離心，用 pH7.0，0.05 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液重懸沉淀，然后用最小100倍體積于樣品的緩沖液(pH 5.3，0.05 mol/L醋酸緩沖液)透析24 h。

1.3.5.2 DEAE Fast Flow離子交換柱層析

透析后的樣品過DEAE層析柱(1 cm×10 cm)，層析柱用pH7.0，0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液預(yù)先平衡。上樣后用相同的緩沖液洗去雜蛋白。結(jié)合到柱料上的蛋白用0～0.1 mol/L的 NaCl(溶解于pH7.0，0.05 mol/L的 Tris-HCl緩沖液)梯度洗脫，流速為1 mL/min，280 nm監(jiān)測(cè)蛋白含量，流出峰用2 mL離心管收集，每管中收集1.5 mL，并分別測(cè)酶活和蛋白含量，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)純度。

1.3.5.3 重組酶XynAeSC去糖基化

10 μL 反應(yīng)體系中加入 XynAeSC(20 μg)和1 μL 10×糖蛋白變性緩沖液，其余體積用水補(bǔ)足，混合均勻，沸水浴中反應(yīng)10 min;然后在此反應(yīng)體系中加入2 μL 10 × G5 緩沖液，1 μL Endo H 酶，添加高純水至總體系為20 μL，37℃反應(yīng)1.5 h，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)純度。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.6.1 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

最適pH的測(cè)定在50℃下進(jìn)行，用不同的緩沖體系配濃度為0.05 mol/L，不同pH的緩沖液。分別是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 2.20～4.20);醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3.80～5.80);MES緩沖液(pH 5.20～7.20);MOPS緩沖液(pH 6.20～8.20);Tris-HCl緩沖液(pH 7.00～9.00);CHES緩沖液(pH 8.15～10.15);CAPS緩沖液(pH 9.30～11.30)。總的pH范圍為2.2～11.3，每種緩沖體系設(shè)5個(gè)點(diǎn)，共35個(gè)pH值。測(cè)定酶活時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)方法中的緩沖液替換為以上不同pH的緩沖液。

pH穩(wěn)定性測(cè)定用上述不同pH的緩沖液稀釋酶液，使酶液處于不同的緩沖條件下，50℃下保溫30 min后立即冰浴終止反應(yīng)，與不保溫的酶液作對(duì)比，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.3.6.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

最適溫度的測(cè)定:將酶液用最適pH緩沖液適當(dāng)稀釋，然后分別在40～95℃的不同溫度下反應(yīng)10 min，測(cè)定木聚糖酶活力，以最大值為100%。

溫度穩(wěn)定性的測(cè)定:將酶液在最適pH緩沖液中，50℃處理30 min后立即取樣冰水浴冷卻，與沒有處理的酶活作對(duì)比，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.3.6.3 酶的底物特異性

以不同的木聚糖為底物(10 g/L)，測(cè)定酶活的緩沖體系為pH8.2的0.05 mol/L MOPS緩沖液，50℃反應(yīng)10 min后測(cè)酶活。與樺木木聚糖為底物測(cè)得酶活值比較。天然底物包括樺木木聚糖、燕麥木聚糖、玉米芯水溶性木聚糖、櫸木木聚糖、玉米芯水不溶性木聚糖、甘蔗渣木聚糖、豆稈木聚糖、棉子殼木聚糖、麩皮木聚糖。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)載體pPIC9K-xynAeSC的構(gòu)建

按2.3.1方法，通過PCR獲得大小約為1 kbp的片段，與理論大小986 bp大小相同。經(jīng)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符。隨后對(duì)表達(dá)載體pPIC9K和片段xynAeSC進(jìn)行酶切處理，膠回收酶切片段，隨后用T4連接酶連接分別經(jīng)內(nèi)切酶Eco RI和Not I處理的表達(dá)載體pPIC9K和目的基因。構(gòu)建表達(dá)載體通過熱擊導(dǎo)入大腸桿菌感受細(xì)胞，平板涂布。待平板上長(zhǎng)出菌落后用菌落PCR法檢測(cè)陽性克隆。

陽性克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)，按照提質(zhì)粒方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。泳道1～5分別代表空載體pPIC9K、重組表達(dá)載體pPIC9K-xynAeSC、pPIC9K-xynAeSC經(jīng)雙酶切后的片段及目的基因xynAeSC片段。泳道3、4說明目的基因已經(jīng)成功克隆到重組表達(dá)載體中，實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)載體體pPIC9K-xynAeSC的構(gòu)建。

圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K-xynAeSC驗(yàn)證電泳圖Fig.1 The result of enzymatic digestion of pPIC9K-xynAeSC

2.2 重組蛋白的表達(dá)和鑒定

采用組氨酸的缺陷培養(yǎng)基方式篩選陽性克隆，得到551個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子。剛果紅染色透明圈法初篩重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，如圖2所示。

圖2 重組酶產(chǎn)生的透明圈Fig.2 The zone of clearance by recombinant enzyme

從551個(gè)重組菌株基因文庫中，篩選得到有透明斑現(xiàn)象的陽性轉(zhuǎn)化子129個(gè)，對(duì)全部陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行快速誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中產(chǎn)酶能力達(dá)到10 U/mL以上的轉(zhuǎn)化子有15個(gè)。最終挑選產(chǎn)酶能力最高GS115/xynAeSC菌落3～20進(jìn)行常規(guī)誘導(dǎo)表達(dá)8 d，并對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。然后在8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。取上清液用改良的DNS法測(cè)定木聚糖酶活性。結(jié)果表明:發(fā)酵液上清液木聚糖酶酶活可達(dá)到229±3 U/mL。

2.3 重組酶的純化

2.3.1 DEAE柱層析

DEAE層析柱(1 cm×10 cm)使用前用pH 7.0，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液預(yù)先平衡，待平衡結(jié)束后上樣，樣品先用相同的緩沖液透析。上樣后用相同的緩沖液洗去不能與柱料結(jié)合的雜蛋白。結(jié)合到柱料上的蛋白用0～0.1 mol/L的 NaCl(溶解于 pH7.0，0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液)梯度洗脫，流速為1 mL/min，280 nm監(jiān)測(cè)蛋白含量，流出峰用2 mL離心管收集，每管收集1.5 mL，分別測(cè)酶活和蛋白含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 DEAE離子交換柱層析Fig.3 DEAE ion exchange chromatography

木聚糖酶經(jīng)過DEAE離子交換層析的純化工作總結(jié)如表2所示，重組木聚糖酶的比活力提高至516.8±6.2 U/mg，回收率可達(dá)44.0% ±1.8%。

2.3.2 木聚糖酶XynAeSC去糖基化

畢赤酵母可對(duì)分泌蛋白進(jìn)行O－和N－連接糖基化修飾［7］，分析木聚糖酶XynAeSC氨基酸序列發(fā)現(xiàn)有4個(gè)糖基化位點(diǎn)。Endo H是一種高效糖苷內(nèi)切酶，能對(duì)重組酶去糖基化。對(duì)重組酶進(jìn)行去糖基化處理后，得到了電泳純的木聚糖酶條帶，結(jié)果如圖4所示，該蛋白分子量大小為34 kDa。

表2 重組木聚糖酶初步純化結(jié)果Table 2 The result of purification of recombinant XynAeSC

圖4 XynAeSC純化過程的電泳圖和酶譜圖Fig.4 The SDS-PAGE and zymogram of recombinant XynAeSC

2.4 重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

重組木聚糖酶XynAeSC在不同pH條件下酶活如圖5所示，當(dāng)反應(yīng)緩沖液為pH7.2的MOPS時(shí)酶活達(dá)到最高，且酶活力穩(wěn)定。當(dāng)pH在6.2～8.6時(shí)，相對(duì)酶活力都在80%以上，當(dāng)pH小于5.2和大于9.2時(shí)，酶活迅速下降。

隨著對(duì)木聚糖酶的認(rèn)識(shí)越來越深刻，更多的木聚糖酶基因在畢赤酵母中得到了表達(dá)。張慧敏［8］等人將1株極端耐熱木聚糖酶基因Syxyn11用畢赤酵母進(jìn)行重組表達(dá)，重組酶的最適pH為6.5，pH穩(wěn)定范圍在5.0～7.5。目前，重組鏈霉菌屬木聚糖酶的最適 pH 多在5.0 ～6.0［9－11］，本試驗(yàn)重組木聚糖酶的最適pH為7.2，且在pH6.2～8.6有較高的相對(duì)酶活，區(qū)別于其他重組酶。

圖5 重組木聚糖酶XynAeSC最適pHFig.5 The optimum pH of recombinant XynAeSC

重組酶XynAeSC在不同的pH下的相對(duì)酶活如圖6所示。50℃處理30 min后，XynAeSC在pH5.3～9.8依然能保持80%以上的相對(duì)酶活力，XynAeSC具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性，在中性偏堿性條件下的情況比較突出，能應(yīng)用于酶法生產(chǎn)低聚木糖。

圖6 重組木聚糖酶XynAeSC pH穩(wěn)定性Fig.6 The pH stability of recombinant XynAeSC

2.4.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

重組木聚糖酶XynAeSC在不同溫度下相對(duì)酶活如圖7所示。最適溫度為70℃，40～60℃之間木聚糖酶的相對(duì)酶活力都在70%以上，而當(dāng)溫度達(dá)到75℃時(shí)殘余酶活急劇下降。Sysyn11基因在畢赤酵母中表達(dá)的外源蛋白最適溫度達(dá)到85℃，這與其來源于極端耐熱木聚糖酶有很大的關(guān)系。說明天然酶的性質(zhì)與重組酶有很大相關(guān)性。Li［12］等用畢赤酵母重組表達(dá)了一個(gè)來源于黑曲霉的木聚糖酶基因，研究發(fā)現(xiàn)重組酶的最適溫度為50℃，溫度穩(wěn)定性在40～60℃，且該酶在低聚木糖制備生產(chǎn)中得到了很好的應(yīng)用。

重組酶XynAeSC在不同溫度下處理30 min，殘留酶活如圖8所示，當(dāng)溫度小于等于60℃時(shí)，保溫30 min，殘留酶活能達(dá)到80%以上，65℃以后木聚糖酶活力急劇下降。

圖7 重組木聚糖酶XynAeSC的最適溫度Fig.7 The optimum temperature of recombinant XynAeSC

圖8 重組木聚糖酶XynAeSC溫度穩(wěn)定性Fig.8 The temperature stability of recombinant XynAeSC

2.4.3 重組酶底物特異性

為了深入了解和研究重組木聚糖酶XynAeSC對(duì)底物的特異性，選擇不同的木聚糖底物，使用同樣的條件測(cè)酶活，結(jié)果如圖9所示。

圖9 重組木聚糖酶XynAeSC底物特異性Fig.9 The substrate specifity of recombinant XynAeSC

以1%樺木木聚糖為底物所測(cè)的木聚糖酶活力為100%，由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，重組酶XynAeSC以燕麥木聚糖為底物時(shí)，酶活力最高，相對(duì)酶活力為樺木的259.7%±10.7%。對(duì)甘蔗渣木聚糖的活力最低，只有樺木木聚糖的16.0% ±1.5%。且上述底物經(jīng)木聚糖酶水解產(chǎn)物主要以木二糖為主，隨著水解時(shí)間的增加，木二糖的含量逐漸增多，經(jīng)過24 h，水解以上幾種底物均沒有木糖生產(chǎn)。這表明，該重組木聚糖酶在生產(chǎn)低聚木糖的應(yīng)用上具有一定的潛力。

2.4.4 CBD結(jié)構(gòu)對(duì)木聚糖酶性質(zhì)的比較

教酒鏈霉菌L1105產(chǎn)的天然木聚糖酶(44 kDa)包含催化結(jié)構(gòu)域(34 kDa)和纖維素結(jié)合域(CBD，約10 kDa)兩部分。在本研究中所表達(dá)的重組木聚糖酶考慮到CBD結(jié)構(gòu)有可能會(huì)影響重組酶在紙漿助漂領(lǐng)域中的應(yīng)用，所以用畢赤酵母表達(dá)不含CBD和信號(hào)肽的酶蛋白(34 kDa)。二者的酶學(xué)性質(zhì)上的差異如表3所示。

表3 單一與復(fù)合結(jié)構(gòu)域的木聚糖酶性質(zhì)差異Table 3 The difference in porperties between two xylanase

通過對(duì)比包含CBD與去除CBD結(jié)構(gòu)的兩種酶性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，這兩種酶的大部分酶學(xué)性質(zhì)是相近似的［13］，個(gè)別性質(zhì)，如 Co2+對(duì)酶活的影響，Co2+對(duì) 34 kDa的酶蛋白有明顯的促進(jìn)作用，但是卻能抑制44 kDa酶蛋白活性，這可能是由于44 kDa木聚糖酶包含有一段CBD結(jié)構(gòu)使酶蛋白質(zhì)構(gòu)象與34 kDa的酶蛋白不同，而導(dǎo)致了Co2+對(duì)其活性中心影響的差異。此外，含有CBD的木聚糖酶能明顯提高對(duì)于麩皮木聚糖和豆桿木聚糖的水解作用，這與纖維素結(jié)合域能改變酶對(duì)底物的親和力有直接關(guān)系。雖然含有CBD結(jié)構(gòu)能在一定程度上增加木聚糖酶對(duì)水不溶性木聚糖的水解作用，但是在某些工業(yè)領(lǐng)域中，如紙漿助漂中，人們希望木聚糖酶的纖維素酶活性盡量低，含有CBD結(jié)構(gòu)無疑對(duì)此是不利的。

3 結(jié)論

本文主要對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶XynAeSC進(jìn)行了產(chǎn)酶條件優(yōu)化，重組酶分離純化并對(duì)該重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。

(1)通過DEAE離子交換層析和Endo H酶去糖基化得到電泳純XynAeSC，SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白分子量為34 kDa，與預(yù)測(cè)分子量大小相符。

(2)重組畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶XynAeSC的最適pH為7.2，50℃處理30 min后，XynAeSC在pH5.3～9.8之間依然能保持80%以上的相對(duì)酶活力;最適反應(yīng)溫度為70℃，60℃溫度下保溫30 min，酶活力仍可保持80%。具有良好的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。重組木聚糖酶XynAeSC對(duì)木聚糖底物表現(xiàn)出特異性，對(duì)燕麥木聚糖特異性最好。

(3)教酒鏈霉菌L1105產(chǎn)木聚糖酶中含CBD結(jié)構(gòu)(44 kDa)，在水解麥麩木聚糖和豆桿木聚糖時(shí)表現(xiàn)出更高的水解能力。另外，Co2+對(duì)44 kDa木聚糖酶酶活有抑制作用，而對(duì)不包含CBD結(jié)構(gòu)的木聚糖酶(34 kDa)酶活有促進(jìn)作用。CBD結(jié)構(gòu)的存在與否對(duì)木聚糖酶的基本性質(zhì)無顯著影響。含與不含CBD結(jié)構(gòu)的兩種酶的大部分酶學(xué)性質(zhì)是相近似的。

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