動態(tài)比濁快速鑒定金黃色葡萄球菌方法建立及應(yīng)用評價

劉濤 ，黃艷芳 ，伍晨輝 ，宋秋月 ，陳開森

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2、南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院檢驗班學(xué)生，江西 南昌 330006)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是臨床常見的致病菌，常導(dǎo)致院內(nèi)感染和社區(qū)感染[1，2]，甚至食物中毒[3]，具有較高的發(fā)病率和病死率。研究資料表明金黃色葡萄球菌是最為常見的革蘭陽性感染菌，特別是近年來隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的擴(kuò)散，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌感染的預(yù)防、治療更加棘手[4]。如何有效、快速、經(jīng)濟(jì)地鑒別金黃色葡萄球菌具有重要的實際意義。目前大部分臨床實驗室鑒別金黃色葡萄球菌常采用商品化試劑及配套儀器，由于成本高，部分實驗室開展具有一定的困難。金黃色葡萄球菌有別于其它細(xì)菌的主要特點是其可產(chǎn)生血漿凝固酶（Plasma coagulase），故根據(jù)細(xì)菌的該生物特征能較好地鑒定金黃色葡萄球菌[5]。目前，部分實驗室，特別是基層實驗室常采用血漿凝固酶法檢測金黃色葡萄球菌，而常用的方法是試管法。然而，部分金黃色葡萄球菌凝固酶產(chǎn)酶量低，短時間內(nèi)不易肉眼觀察，而常被認(rèn)為假陰性；此外，少數(shù)菌株可產(chǎn)生葡激酶（Staphylokinase），可導(dǎo)致血漿凝集物解集，出現(xiàn)假陰性[6，7]。 在保證血漿凝固酶方法的有效檢測的前提下如何降低假陰性對金黃色葡萄球菌鑒別的影響具有重要臨床價值。本課題組根據(jù)現(xiàn)有經(jīng)驗，摸索出一套采用動態(tài)比濁鑒別金黃色葡萄球菌的方法，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC2592 3），表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC26069），實驗室自留，購于中國菌種保存中心。臨床分離菌株經(jīng)VITEK-2-compact鑒定，所有菌株的鑒定率（identi-fication rate）≥98%，包括金黃色葡萄球菌64株，非金黃色葡萄球菌114株。所有金黃色葡萄球菌經(jīng)PCR擴(kuò)增特異性耐熱核酸酶（nuc）基因進(jìn)行再確定。

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及5%羊血瓊脂培養(yǎng)基均由實驗室自配，人EDTA抗凝混合血漿來源于本院常規(guī)體檢健康患者，所有操作符合全國臨床檢驗操作規(guī)程[8]。

1.1.3 主要試劑及儀器 VITEK-2-compact及其配套試劑購于法國梅里埃公司；Biotek比濁儀購于美國BIO-READ公司；恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺為國產(chǎn)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 確定動態(tài)比濁法檢測的最佳波長

1.2.1.1 菌液的制備 首先將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC25923從-80℃低溫冰箱取出，常溫復(fù)蘇1小時后接種于肉湯，搖勻后用接種環(huán)挑取1環(huán)接種于血平板上，37℃培養(yǎng)16~18h，操作前取血平板上2~3個菌落接種到肉湯中37℃培養(yǎng)2~3h，隨后3000r/min離心3min，倒棄肉湯，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液沉淀使?jié)舛葹?個麥?zhǔn)蠁挝弧ｊ幮詫φ詹捎帽砥て咸亚蚓鷺?biāo)準(zhǔn)株ATCC26069。

1.2.1.2 操作步驟 向96孔板中的每孔加入血漿90 μl及菌液 10μl， 將反應(yīng)混合液放置于 340nm、405nm、450nm、540nm、590nm 和 630nm 波長下檢測吸光度值的變化，反應(yīng)溫度為37℃，設(shè)定檢測時限6h，每2min檢測一次。如果吸光度值增大0.05，則認(rèn)為反應(yīng)體系的吸光度值有變化 （儀器本身設(shè)定），并認(rèn)為菌株產(chǎn)生了血漿凝固酶。

1.2.2 動態(tài)比濁法檢測金黃色葡萄球菌的特異性為了觀察該方法鑒別金黃色葡萄球菌是否具有特異性，我們對臨床分離的64株金黃色葡萄球菌、114株革蘭染色陽性非金黃色葡萄球菌的球菌進(jìn)行鑒別。具體方法如下：加入10μl濃度為1麥?zhǔn)蠁挝痪旱?90μl混合人血漿中，340nm、37℃反應(yīng)，每隔2min判讀吸光度值，共計6h。

1.2.3 動態(tài)比濁法檢測金黃色葡萄球菌的敏感性為了觀察動態(tài)比濁鑒別金黃色葡萄球菌的敏感性，我們比較分析試管法和動態(tài)比濁法對88株金黃色葡萄球菌的鑒別時限。具體方法：動態(tài)比濁法為加入10μl濃度為1麥?zhǔn)蠁挝坏慕瘘S色葡萄球菌菌液到90μl混合人血漿中，340nm、37℃反應(yīng)，設(shè)定每隔2min判讀吸光度值，共計6h。試管法則是向小試管內(nèi)加入50μl濃度為1麥?zhǔn)蠁挝坏慕瘘S色葡萄球菌菌液，同時加入450μl混合人血漿，37℃反應(yīng)，每隔30min判讀是否出現(xiàn)凝集，共計6h。

1.2.4 動態(tài)比濁法對臨床分離金黃色葡萄球菌的快速鑒定 參照VITEK-2-compact對菌株的鑒定，這些菌株包括葡萄球菌、腸球菌等革蘭染色陽性的球菌共計189株，標(biāo)本的分離、培養(yǎng)及鑒定符合臨床檢驗操作規(guī)程[8]。具體方法：加入10μl濃度為1麥?zhǔn)蠁挝坏木旱?0μl混合人血漿中，340nm、37℃反應(yīng)，設(shè)定每隔2min判讀吸光度值，共計6h。

1.3 數(shù)據(jù)分析 以VITEK-2-compact檢測結(jié)果作為參考方法，χ2檢驗分析2h或6h動態(tài)比濁和試管法檢測血漿凝固酶的差別；u檢驗分析動態(tài)比濁與試管法檢測血漿凝固酶的敏感性差異。

2 結(jié)果

2.1 方法的可行性 為了了解動態(tài)比濁法檢測金黃色葡萄球菌是否可區(qū)別于其它細(xì)菌，我們采用金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測分析，結(jié)果如圖1所示：金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25923）的吸光度值隨反應(yīng)時間延長而上升（OD≥0.05），而表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC26069）的吸光度值一直處于水平狀態(tài)。

圖1凝固酶陽性葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌反應(yīng)曲線

2.2 反應(yīng)最佳波長 參照儀器本已固定設(shè)定的340nm、405nm、450nm、490、540nm 和 630nm 波 段進(jìn)行檢測，6h內(nèi)每隔10~20min對吸光度值進(jìn)行測定，相同時間內(nèi)，340nm處的OD值升高最快，且一直維持在高水平，故認(rèn)為變化最為敏感，從而我們認(rèn)為340nm處檢測效果最好。見圖2。

2.3 動態(tài)比濁法的特異性和敏感性 采用試管法血漿凝固酶作對照，分析動態(tài)比濁法的敏感性和特異性。結(jié)果表明2h內(nèi)64株金黃色葡萄球菌中共計58株（90.9%）被鑒定，而試管法僅鑒別38株（59.4%），χ2檢驗無差別（χ2=3.42，P=0.064），但陽性出現(xiàn)的時間差異明顯 （u=3.26，P＜0.001）；6h 內(nèi)動態(tài)比濁法鑒別63株（98.4%），而試管法僅鑒別54株（84.4%），χ2檢驗值沒有差別（χ2=0.46，P=0.50），但鑒別結(jié)果陽性出現(xiàn)時間明顯早于試管法 （u=2.39，P＜0.01）（表 1）。

圖2不同時間、不同波長下動態(tài)比濁體系OD值變化曲線

表1 動態(tài)比濁與試管法診斷金黃色葡萄球菌相關(guān)參數(shù)

2.4 臨床菌株鑒定 采用動態(tài)比濁法隨機(jī)對臨床分離的189株革蘭染色陽性球菌鑒別是否為金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)所有的88株金黃色葡萄球菌被鑒別出（鑒別準(zhǔn)確性100%）；而101株非金黃色葡萄球菌僅1株鑒定為陽性，后經(jīng)VITEK-2-compact確定為中間葡萄球菌，故認(rèn)為動態(tài)比濁法鑒別金黃色葡萄球菌結(jié)果可靠。

3 討論

金黃色葡萄球菌是臨床常見的致病性革蘭陽性菌，常導(dǎo)致中毒及社區(qū)、醫(yī)院感染，對金黃色葡萄球菌的快速準(zhǔn)確診斷是治療的前提條件。目前雖然商品化試劑獲得廣泛使用，但成本較高，基礎(chǔ)實驗室較難開展。血漿凝固酶試驗方法簡單，幾乎每個實驗室都可開展，聯(lián)合菌落形態(tài)，溶血情況等可準(zhǔn)確地對金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速鑒別[8]。然而，由于試管法檢測血漿凝固酶的敏感度低，故短時間內(nèi)不能有效地對金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒別，如表1所示，2h內(nèi)其鑒別率僅為0.594。反應(yīng)時間過長則產(chǎn)生的葡激酶對纖維蛋白復(fù)合物水解而導(dǎo)致假陰性。本研究根據(jù)血漿凝固酶可水解纖維蛋白原為纖維蛋白，導(dǎo)致血漿吸光度值升高，設(shè)計了動態(tài)比濁法檢測血漿凝固酶，反應(yīng)曲線見圖1。通過對不同波長檢測獲得結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)最佳檢測波長為340nm（圖2），這與文獻(xiàn)報道有些差異[9]，考慮到作者加入藥物對體系的影響，故認(rèn)為兩者間差異較小。

動態(tài)比濁法的主要優(yōu)勢體現(xiàn)在不間斷地實時檢測反應(yīng)體系中吸光度值的變化，這種變化肉眼不能判斷，故速度更快、更準(zhǔn)確。因為金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的致病能力且常導(dǎo)致食品中毒，故更快地獲得確切的結(jié)果對于有效地控制疾病的進(jìn)展及其預(yù)防和治療具有重要的價值。

商品化試劑檢測金黃色葡萄球菌雖然操作簡便，但需時較長且昂貴。試管法血漿凝固酶則需要較多的人力，如果全部鑒別出，往往需要培養(yǎng)過夜。對于病情嚴(yán)重或食物中毒患者而言，及時鑒定的時間往往可決定病情的進(jìn)展及治療的預(yù)后。本研究在對臨床分離的189株革蘭陽性球菌采用參考方法進(jìn)行鑒別檢測時，88株金黃色葡萄球菌全部被檢測出，而采用6h動態(tài)比濁法共計檢測到87株菌，鑒定符合率達(dá)98.9%（87/88）；相同時間采用的試管法檢測率僅為檢測到75株，鑒定符合率為85.2%，兩者出現(xiàn)鑒別結(jié)果的時間點差異明顯 （u=2.39，P＜0.01）；如果以2h作為時間點來觀察，時間出現(xiàn)的順序差異則更加明顯（u=3.26，P＜0.001）。 如果將試管法進(jìn)行過夜培養(yǎng)判斷，雖然可檢測出血漿凝固酶含量低的菌株，但考慮到金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生葡激酶對纖維蛋白復(fù)合物的水解而導(dǎo)致假陰性，故陽性率與6h判斷差異不大[11]。動態(tài)比濁法克服了試管法的上述缺陷，表現(xiàn)為檢測能力更敏感，且可實時地監(jiān)測體系OD值變化，故可觀察到葡激酶對復(fù)合物的水解作用（表現(xiàn)為OD值下降）。相比于試管血漿凝固酶法對金黃色葡萄球菌的鑒定，動態(tài)比濁法僅需動態(tài)比濁器而幾乎不需要配套耗材，故不存在成本增加及工作量增大的問題。考慮到檢測時間及敏感性的優(yōu)勢，故我們認(rèn)為該方法可有效地代替試管法檢測血漿凝固酶鑒別金黃色葡萄球菌。

[1]許華，肖江.1989株下呼吸道感染病原菌的構(gòu)成、分布及耐藥特點分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2012，30(6)：635-636.

[2]周啟立，任磊，郭健，等.不同胎齡新生兒社區(qū)獲得性敗血癥晚發(fā)型的臨床分析[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35(4)：576-579.

[3]Knox J，Uhlemann AC，Lowy FD.Staphylococcus aureus infections：transmission within households and the community[J].Trends Microbiol，2015，23(7)：437-444.

[4]Machuca MA，Sosa LM，Gonzalez CI.Molecular typing and virulence characteristic of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from pediatric patients in Bucaramanga，Colombia[J].PloS One，2013，8(8)：e73434.

[5]Luijendijk A，van Kelkum A，Verbrugh H，et al.Comparison of five tests for identification of Staphylococcus aureus from clinical samples[J].JClin Microbiol，1996，34(9)：2267-2269.

[6]Prasad B，Salunkhe SS，Padmanabhan S.Novel self-cleavage activity of Staphylokinase fusion proteins：an interesting finding and itspossibleapplications[J].Protein Expr Purif，2010，69(2)：191-197.

[7]紀(jì)智星，韓潤林.纖維蛋白原在金黃色葡萄球菌感染中的作用[J].生命科學(xué)，2010，22(5)：449-453.

[8]葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全部臨床檢驗操作過程[M].第3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：755-770.

[9]Vanassche T，Verhaegen J，Peetermans WE，et al.Dabigatran inhibits Staphylococcus aureus coagulase activity[J].J Clin Microbiol，2010，48(11)：4248-4250.

[10]陳旭，顧飛飛，李潔，等.三種表型試驗和聯(lián)合鑒定金黃色葡萄球菌能力的評估 [J].中華微生物和免疫學(xué)雜志，2013，33(5)：355-360.