持續緩慢放松止血帶對肢體缺血再灌注損傷的保護作用

郭俊艷，皮紅英，王建榮

長時間應用止血帶后，肢體局部血液循環中斷，止血帶下及遠端組織會發生缺血性損傷，而一旦放松止血帶使血液循環恢復后，缺血組織則會發生涉及局部組織及全身多器官的再灌注損傷。傳統觀點認為減少缺血時間是降低損傷程度的唯一重要的干預措施，然而現在已清楚認識到缺血組織再灌注后引發的一系列復雜反應使組織細胞損傷持續存在并加重［1］。因此如何有效地防治肢體缺血再灌注損傷，降低肢體的傷殘率和全身性損害是目前研究的重要領域。有文獻報道，臨床四肢手術應用止血帶后，采用分次緩慢放氣可減緩血壓下降、減輕心率變化程度以及預防止血帶休克的發生［2］。但這種方法是否有利于減輕止血帶放松后所繼發的缺血再灌注損傷尚未見報道，因此，本研究參考既往文獻報道的分次緩慢放氣的干預方法，通過動物實驗觀察對減輕組織再灌注損傷的作用，為臨床防治止血帶損傷提供方法支持及理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康比格犬18只，雌雄不拘，體重10.0kg～12.0kg（11.5kg±1.3kg）。由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，為清潔級動物。

1.2 實驗方法 比格犬實驗前12h禁食，可自由進水，實驗前0.5h置于手術室，手術室內溫度為20℃左右。經耳緣靜脈推注3%戊巴比妥鈉（1g/kg）麻醉，麻醉成功后仰臥位固定于手術臺上，右前肢腋前區及右后肢局部脫毛，手術分離右股動脈、股靜脈，暴露右肱動脈。將TS402雙通道血流儀探頭鉗夾于肱動脈處以監測動脈血流量，BLF21激光多普勒血流探針經皮插入右前肢遠端皮下組織以監測遠端組織血流量，股動脈插管并以肝素抗凝，以實時監測血壓。將18只比格犬隨機分為3組，每組6只。假手術組（S組）僅暴露右前肢肱動脈而不阻斷動脈血流；快速放松組（RR組）采用德國VBM280OELC電動止血儀，止血袖帶縛扎于犬右前肢，緩慢加壓充氣，經TS402雙通道血流儀監測動脈血流量為0時停止充氣，并持續阻斷動脈血流3h。隨后，快速放松止血帶，即按壓電動止血儀放氣按鈕，瞬間快速放松袖帶內氣體，恢復肢體血流灌注。持續緩慢放松組（SR組）阻斷肱動脈血流3h后（方法同RR組），給予持續緩慢放松充氣止血帶，即緩慢旋轉電動止血儀氣壓按鈕，第1分鐘放松1/2充氣壓力，第2分鐘放松余下的1/2壓力，第3分鐘放松剩余壓力，恢復肢體血流灌注。所有動物均予40mL/kg生理鹽水進行液體復蘇并保溫至全身麻醉蘇醒。

1.3 標本采集與處理

1.3.1 血標本的采集與處理 各組分別于阻斷3h及放松3h、6h、24h于右股靜脈穿刺取血約5mL，以3 500r/min離心10min，分離血清后裝入Eppendorf管置于－70℃超低溫冰箱中保存以備檢測各項指標。S組以對應時間點為采血時間。

1.3.2 組織標本的采集與處理 各組分別于阻斷3 h、放松3h依次于右前肢內側縱行切開皮膚，游離皮膚及皮下組織，切取250mg肌組織放入液氮中凍存備用；取250mg肌組織置于10%甲醛液體中保存，常規石蠟包埋和切片（4μm厚），以備組織學檢查；另取一塊肌組織放于裝有電鏡固定液的小瓶內，－4℃冰箱保存。

1.4 觀察及檢測指標

1.4.1 血液循環指標的觀察 于放松止血帶后1 min、2min、5min、10min、15min 5個時間點觀察并記錄動物收縮壓、舒張壓、平均動脈壓，以及縛扎止血帶一側肢體的肱動脈血流量和遠端組織血流量。

1.4.2 骨骼肌丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測定 取出液氮凍存的組織標本100mg，用4℃生理鹽水洗去血污，每項測定稱取1.0g濕組織，加入0.2mol/L的緩沖液5mL，pH 7.3，用組織勻漿器在低溫下研磨成勻漿，然后以10 000r/min離心20 min，取上清液。再分別采用相應試劑盒進行檢測，所有步驟嚴格按試劑盒要求。操作結束后分別采用紫外分光光度法、半自動生化分析儀及酶標儀檢測并計算MDA和SOD含量。

1.4.3 血清乳酸脫氫酶（LDH）、內皮素－1（ET－1）測定 將血清從－70℃超低溫冰箱中取出，置于37℃恒溫水浴鍋內解凍，待解凍后取出血清加入檢測試劑，采用全自動生化分析儀檢測LDH、LDH含量。

1.4.4 組織病理學染色及電鏡標本制作 ①電鏡標本的制作方法：3%戊二醛浸泡2h，將標本切成約1 mm×1mm×1mm組織塊，然后用緩沖液反復洗滌2 h～3h，再加入1%鋨酸固定2h，經緩沖液沖洗3次，每次15min，各級乙醇充分脫水，環氧樹脂包埋、超薄切片機切片，鈾鉛染色。透射電鏡下觀察、攝片。圖片采用圖像分析系統測量、分析。②組織病理學染色標本的制作方法：將所取組織標本放入10%甲醛溶液中固定24h后，經常規酒精脫水、石蠟包埋，制成5μm切片，行常規蘇木精－伊紅（HE）染色。

1.5 統計學處理 應用SSPS 13.0統計軟件包進行分析處理，所得數據以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗比較兩組間差別，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺血再灌注后血液循環的變化

2.1.1 動脈血流量的變化 放松止血帶后，RR組和SR組動脈血流量及組織血流量迅速增加，1min即達峰值，顯著高于S組（P＜0.01）。RR組動脈血流量波動較大，1min時為（46.00±3.74）mL/min，2min時迅速下降至（12.67±1.75）mL/min，而SR組1min時動脈血流量為（30.17±2.23）mL/min，2min時降至（18.67±3.33）mL/min，其變化程度明顯小于 RR組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組放松后不同時間點動脈血流量的變化情況（n＝6，±s） mL/min

表1 各組放松后不同時間點動脈血流量的變化情況（n＝6，±s） mL/min

1min 2min 5min 10min 15min S組 23.33±2.58 23.17±1.47 24.23±2.73 24.00±3.5組別2 23.35±2.88 RR組 46.00±3.742） 12.67±1.752） 20.67±3.081） 24.00±4.29 25.33±3.62 SR組 30.17±2.232）3） 18.67±3.333） 21.56±3.14 23.41±2.34 23.53±2.25與S組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與RR組比較，3）P＜0.01。

2.1.2 組織血流量的變化 RR組在放松1min時組織血流量為（1 095.00±292.25）BPU/min，而SR組為（630.00±104.64）BPU/min，兩組比較，SR組明顯低于RR組（P＜0.01。兩組組織血流量在放松1min達到峰值后迅速下降，直至放松10min才逐漸恢復，與S組比較差異無統計學意義（P＞0.05），但SR組下降的幅度明顯低于RR組，尤其在2min和5min時差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組放松后不同時間點組織血流量的變化情況（n＝6，±s） BPU/min

表2 各組放松后不同時間點組織血流量的變化情況（n＝6，±s） BPU/min

1min 2min 5min 10min 15min S組 293.33±66.53 304.67±63.14組別315.00±72.04 323.33±92.66 296.67±61.54 RR組 1 095.00±292.251） 836.67±118.051） 610.00±105.301） 433.75±95.21 340.33±66.60 SR組 630.00±104.643） 536.67±101.723） 485.00±81.922） 368.33±92.61 341.67±75.48與S組比較，1）P＜0.01；與RR組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

2.1.3 平均動脈壓及心率的變化 放松止血帶后，RR組和SR組平均動脈壓明顯降低，至5min時達最低 值，RR組為（104.33±4.25）mmHg（1mmHg＝0.133kPa），SR組為（110.50±4.47）mmHg，顯著低于S組（P＜0.05或P＜0.01）。兩組心率則明顯增快，放松5min時達峰值，RR組為（196.17±8.26）/min，SR組為（1 8 5.8 3±7.2）/min，顯著高于S組（P＜0.05）。兩組比較，SR組平均動脈壓明顯高于RR組，尤其在放松2min、5min時差異有統計學意義（P＜0.05）；SR組心率的變化程度也明顯小于RR組，在放松5 min時差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組平均動脈壓和心率放松10min時逐漸恢復。詳見表3、表4。

表3 各組放松后不同時間點平均動脈壓的變化情況（n＝6，±s） mmHg

表3 各組放松后不同時間點平均動脈壓的變化情況（n＝6，±s） mmHg

1min 2min 5min 10min 15min S組 119.83±3.97 118.79±6.15 118.00±5.28 118.67組別±5.23 119.74±5.56 RR組 114.83±2.401） 108.33±3.832） 104.33±4.252） 114.33±5.24 116.00±6.39 SR組 116.33±3.01 114.00±3.411）3） 110.50±4.471）3） 113.83±1.72 115.33±5.16與S組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與RR組比較，3）P＜0.05。

表4 各組放松后不同時間點心率的變化情況（n＝6，x±s） /min

2.2 缺血再灌注后骨骼肌組織MDA、SOD變化

2.2.1 MDA的變化 與S組比較，RR組和SR組MDA含量于阻斷3h開始增加，至放松3h達到高峰，RR組為（3.10±0.70）nmol/mg，SR組為（2.48±0.58）nmol/mg，隨后略有下降，但 RR組在各時間點及SR組在放松3h時間點顯著高于S組（P＜0.05）。兩組比較，SR組MDA含量在各時間點低于RR組，尤其在放松6h、放松24h時差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表5。

表5 各組不同時間點組織MDA含量的變化情況（n＝6±s） nmol/mg

表5 各組不同時間點組織MDA含量的變化情況（n＝6±s） nmol/mg

24h S組組別 阻斷3h 放松3h 放松6h 放松1.75±0.75 1.76±0.83 1.78±0.85 1.74±0.76 RR組 2.60±0.641） 3.10±0.701） 3.02±0.761） 2.78±0.861）SR組 2.23±0.29 2.48±0.581） 2.08±0.632） 1.65±0.692）與S組比較，1）P＜0.05；與RR組比較，2）P＜0.05。

2.2.2 組織SOD的變化 與S組比較，RR組和SR組SOD含量于阻斷3h開始顯著下降，至放松6h達到最低值，RR組為（198.54±23.72）U/mg，SR組為（229.36±21.65）U/mg，放松24h雖有回升，但仍顯著低于S組（P＜0.01）。兩組比較，SR組組織SOD含量在各時間點上明顯高于RR組，尤其在放松3h、6 h時差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表6。

表6 各組不同時間點組織SOD的變化情況（n＝6±s） U/mg

表6 各組不同時間點組織SOD的變化情況（n＝6±s） U/mg

組別 阻斷3h 放松3h 放松6h 放松.78±28.92 RR組 231.92±22.871） 207.40±22.581） 198.54±23.721） 204.96±22.441）SR組 250.68±26.281） 238.39±23.791）2） 229.36±21.651）2） 213.86±20.891）與S組比較，1）P＜0.01；與RR組比較，2）P＜0.05。24h S組 314.54±22.90 313.62±24.78 314.32±22.65 314

2.3 缺血再灌注后血清LDH、ET－1的變化

2.3.1 血清LDH的變化 與S組比較，RR組和SR組血清LDH含量于阻斷3h開始明顯升高，此后呈現持續上升趨勢，至放松24h達到高峰，RR組為（528.00±31.69）U/L，SR組為（428.40±19.05）U/L，顯著高于S組。兩組比較，SR組血清LDH含量在阻斷3h、放松3h、放松24h均顯著低于RR組，差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見表7。

表7 各組不同時間點血清LDH的變化情況（n＝6±s） U/L

表7 各組不同時間點血清LDH的變化情況（n＝6±s） U/L

24h S組 102.40±12.62 103.80±14.97 103.00±17.51 104組別 阻斷3h 放松3h 放松6h 放松.60±16.02 RR組 242.60±21.521） 295.80±15.271） 326.00±19.171） 528.00±31.691）SR組 196.80±12.111）2） 251.20±13.141）2） 327.40±15.451） 428.40±19.051）與S組比較，1）P＜0.01；與RR組比較，2）P＜0.01。

2.3.2 血清ET－1的變化 與S組比較，RR組和SR組血清ET－1的含量于阻斷3h開始明顯升高，RR組于放松3h時達到高峰（1.42±0.25）ng/mL，SR組于放松6h達峰值（0.79±0.20）ng/mL，此后逐漸下降，但兩組各時間點均顯著高于S組（P＜0.01）。兩組比較，SR組血清ET－1含量在各時間點上低于RR組，除放松24h外，其他時間點差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表8。

表8 各組不同時間點血清ET－1的變化情況（n＝6±s） ng/mL

表8 各組不同時間點血清ET－1的變化情況（n＝6±s） ng/mL

24h S組組別 阻斷3h 放松3h 放松6h 放松0.06±0.03 0.04±0.02 0.05±0.02 0.05±0.04 RR組 1.18±0.252） 1.42±0.252） 1.12±0.252） 0.25±0.142）SR組 0.64±0.192）4） 0.74±0.272）4） 0.79±0.202）3） 0.18±0.101）與S組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與RR組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01。

2.4 缺血再灌注后骨骼肌組織的病理改變 組織切片HE染色顯示：S組肌纖維排列整齊，橫紋清晰，染色均勻，肌間質無充血滲出，見圖1；SR組和RR組均有病理形態改變，阻斷3h與S組比較，兩組骨骼肌細胞水腫、變性，肌間隙增寬，見圖2、圖3。放松3h與S組比較，兩組骨骼肌細胞水腫明顯，間質血管擴張充血，中性粒細胞浸潤，炎性反應明顯。RR組炎性反應程度較SR組明顯加重，中性粒細胞明顯增多，并可見肌細胞溶解、點狀壞死。見圖4、圖5。

2.5 缺血再灌注后骨骼肌超微結構觀察 電鏡觀察：S組骨骼肌細胞結構清晰，肌漿內肌原纖維排列整齊，見圖6、圖7。阻斷3h與S組比較，兩組線粒體腫脹，肌漿網水腫變粗，部分肌漿網消失，肌纖維橫紋不清，個別線粒體出現溶解，肌絲水腫斷裂，Z帶及M線不清晰，兩組超微結構改變相似，見圖8、圖9。放松3h RR組肌漿網消失，線粒體溶解，出現空泡，肌纖維橫紋不清。SR組肌漿網部分消失，但未出現線粒體的大片溶解現象，見圖10、圖11。

［本文圖1～圖11見封三］

3 討論

3.1 持續緩慢放松有助于維持血液循環穩定 血液循環的穩定是維持機體正常生命活動的基礎［2］。本研究顯示，肢體阻斷3h在恢復血液循環后動脈血流量和組織血流量迅速增加，RR組在止血帶放松1min時肱動脈血流量迅速升至（46.00±3.74）mL/min，遠高于S組。動脈血流量的大小主要取決于血管兩端的壓力差和血管對血流的阻力。肢體血液循環長時間被阻斷后可造成止血帶平面以上與缺血肢體遠端血管內的壓力差，一旦放松止血帶，阻斷平面以上的動脈血流量迅速涌入遠端缺血肢體，使遠端肢體的動脈血流量急劇增加。平均動脈壓是一個心動周期中動脈血壓的平均值［3］。研究發現，RR組在放松止血帶后，平均動脈壓明顯下降，直至放松10min才逐漸得以恢復，而心率表現為明顯增快，顯著高于S組。可能在放松止血帶后，缺血肢體缺血期間無氧代謝所聚集的二氧化碳、組胺等代謝產物也會進入循環，引起微循環的廣泛開放，血管床容積增大，靜脈回心血量減少、心輸出量降低，從而導致血壓下降、心率增快。有文獻報道，在應用止血帶行四肢手術的99例病人中，有74例在松解止血帶后發生不同程度的血壓下降、脈搏增快、心悸不適等反應，其中有3例發生嚴重全身反應［4］。在本研究中，放松止血帶后平均動脈壓及動脈血流量均出現不同程度的下降。

本研究還顯示，SR組動脈血流量、平均動脈壓及心率的變化程度明顯小于RR組，說明對減輕放松止血帶后血液循環的波動起到一定作用。該研究結果與相關文獻報道基本一致［2］，但與其所采用的間隔3min分兩次放氣的方法相比，本研究所采取的放松方法使袖帶內氣體的排放速度更加均勻。本研究還發現，持續緩慢放松方法可降低松解止血帶后組織血流量的增加程度，進一步證實持續緩慢放松方法在再灌注早期階段通過機械調控再灌注血流，降低止血帶阻斷平面以上血液流入肢體缺血區域的速度，改善再灌注時的高壓力、高動力和高灌注狀態，避免短時間內血液大量涌入缺血區對體循環血容量的影響，從而有助于維持血液循環穩定。

對于阻斷時間的選擇，已往動物實驗表明，缺血時間不超過3h，肌細胞內ATP分解、pH降低、磷酸肌酸耗竭將隨著缺血再灌注開始恢復，組織改變為可恢復性細胞變性，骨骼肌基本可以耐受［5，6］，如阻斷長達4h～6h，肌細胞將出現不可逆的損傷［5，7］，故本實驗選擇阻斷3h為再灌注起始時刻以便更好地研究持續緩慢放松對犬骨骼肌缺血再灌注損傷的影響。

3.2 持續緩慢放松可減輕再灌注后肢體骨骼肌細胞的損傷 缺血再灌注損傷的機制尚未完全闡明，目前較為普遍接受的是“自由基損傷學說”“炎癥反應學說”［8，9］。研究表明，肌肉組織缺血再灌注后數分鐘內，血液和組織內的氧自由基含量可顯著增加［10］。自由基的產生主要通過黃嘌呤氧化酶的激活、中性粒細胞的活性暴發、兒茶酚胺的自身氧化等途徑，通過與生物膜磷脂中的多價不飽和脂肪酸作用，形成一系列脂質過氧化物，導致脂質過氧化損傷，并生成大量的MDA破壞組織蛋白，使細胞進一步遭到損害。MDA是脂質過氧化反應的主要代謝產物之一，可反映組織中自由基的含量和自由基引發的脂質過氧化反應程度，間接反映細胞受自由基氧化損傷的程度。SOD是體內主要的抗氧化酶，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，可清除超氧陰離子（O－2）及H2O2所引起的歧化反應，保護細胞免受自由基的損傷，SOD活性可間接反映機體清除氧自由基的能力。正常骨骼肌細胞內含有豐富的LDH，當細胞發生壞死后其胞內容物進入血流，因此測定血漿中特定酶含量的變化可作為缺血后肌細胞損傷的指標。本研究選用組織MDA、SOD以及血清LDH等指標反映缺血再灌注后組織損傷水平。

本研究表明，SR組骨骼肌組織MDA及血清LDH含量明顯低于RR組，組織SOD則顯著增加，說明持續緩慢放松可減輕缺血再灌注后脂質過氧化反應，提高SOD的活力，這可能與控制止血帶放松速度，減緩血流灌注，減少無氧代謝產物進入循環，進而減少氧自由基的產生等有關。通過光鏡和電鏡觀察骨骼肌細胞病理形態及超微結構，放松3h，SR組細胞器損傷程度較快速放松組輕，鏡下結果與 MDA、SOD和LDH的檢測結果一致，進一步說明持續緩慢放松可減輕缺血再灌注后骨骼肌組織的損傷程度。

3.3 持續緩慢放松可減輕再灌注后血管內皮細胞的損傷 ET－1是由血管內皮細胞分泌的，具有廣泛生物學活性的多肽類物質，是目前已知體內作用最強和作用時間最持久的縮血管物質，也是一種內源性損傷因子。完整的內皮細胞可以分泌氧化亞氮合酶、內皮素、前列環素、腺苷等化合物，維持正常的微循環。研究表明血管內皮細胞功能障礙是缺血再灌注損傷的主要原因之一，缺血再灌注損傷造成毛細血管內皮腫脹、微血栓嵌頓及血栓形成、血管痙攣、白細胞黏附、紅細胞聚集和組織水腫，形成微循環無復流現象又進一步加重缺血性損害［11］。

本研究結果顯示，RR組血清內皮素的含量于阻斷3h開始明顯升高，在放松3h時達到高峰，此后逐漸下降，但仍高于S組，提示微血管內皮功能受損。而SR組血清內皮素水平明顯低于RR組，除放松24h外，其他時間點差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。說明持續緩慢放松對保護血管內皮細胞功能起到一定作用，其原因可能與持續緩慢放松促進血液循環穩定，改善微循環，有助于消除復流后產生的氧自由基，進而減輕內皮損傷有關。Loukogeorgakis等［12］發現，在肢體缺血再灌注之前給予數次短暫再灌注/缺血的后適應處理可以改善健康志愿者缺血再灌注后的內皮功能不全，并指出原因可能是激活了內源性保護機制：抑制再灌注早期的氧自由基損傷、鈣超載、線粒體通透性轉換孔道（MPTP）的開放以及促進氧化亞氮合酶的表達，KATP通道的開放。本研究應用的持續緩慢放松方法雖然與后適應處理方法不完全相同，但都是施加于缺血再灌注肢體的保護措施，在一定程度上提高了機體對缺血的耐受性，發揮了對內皮細胞功能的保護作用。

4 小結

相對于常規的快速放松止血帶的方法，持續緩慢放松止血帶可減輕缺血組織的再灌注損傷，主要原因可能是持續緩慢方法有助于維持血流循環的穩定，減輕脂質過氧化反應及血管內皮的損傷程度，所以對肢體缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

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