低溫腸內(nèi)喂養(yǎng)對(duì)胃缺血再灌注損傷大鼠影響的實(shí)驗(yàn)研究

戴 利，羅利娜，曾秋霞

胃缺血再灌注損傷（gastric ischemia－reperfusion injury，GI－RI）是臨床常見(jiàn)的一種病理現(xiàn)象，腫瘤壞死因子－α（TNF－α）在胃缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用［1，2］。研究表明，低溫能抑制缺血再灌注損傷所致的 TNF－α水平，減輕組織損傷［3－5］。為了證實(shí)低溫腸內(nèi)喂養(yǎng)是否在胃缺血再灌注損傷中同樣具有減輕組織損傷作用，本研究應(yīng)用大鼠建立胃缺血再灌注模型，灌入不同溫度腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液，探討其作用及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 選取健康雄性SD 4月齡大鼠40只，體重250g～280g，肛溫37.1℃～38.5℃，由南華大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（湘）2010－0006，實(shí)驗(yàn)方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。將大鼠隨機(jī)分為腸內(nèi)喂養(yǎng)溫度10℃組、24℃組、32℃組、40℃組。實(shí)驗(yàn)前禁食18h，自由飲水。按 Wada等［6］方法建立胃缺血－再灌注模型，給予10%水合氯醛腹腔麻醉，仔細(xì)分離腹腔動(dòng)脈及周圍組織，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腹腔動(dòng)脈30min后去除動(dòng)脈夾，關(guān)腹。

1.2 腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng) 選用德國(guó)Milupa GmbH公司生產(chǎn)的百普素，為短肽型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑，126g加水配制成500mL，1mL＝1kcal（1kcal＝4.18kJ），所有營(yíng)養(yǎng)液均于灌胃前30min配制，分別放于已設(shè)定溫度的恒溫水浴箱中。每只大鼠按各自手術(shù)時(shí)間術(shù)后2h開(kāi)始腸內(nèi)喂養(yǎng)，第1個(gè)24h攝入量為正常大鼠日需總量［200 kcal/（kg·d）］的1/3，第2個(gè)24h攝入量為總量的1/2，每日6次按時(shí)灌胃。

1.3 主要試劑盒 兔抗TNF－α多克隆抗體（美國(guó)Bioworld公 司），大 鼠 TNF－αELISA 試 劑 盒 （Biosource公司）。

1.4 測(cè)定樣品的制備 大鼠胃缺血再灌注損傷術(shù)后48h予深麻醉下取心臟靜脈血5mL后開(kāi)腹取胃并迅速測(cè)定胃黏膜損傷指數(shù)，留取腺胃測(cè)定TNF－α水平。

1.5 胃黏膜損傷指數(shù)測(cè)定 將每個(gè)鼠胃進(jìn)行編號(hào)后由一位不參與實(shí)驗(yàn)的觀察者在10倍放大鏡下測(cè)定胃黏膜損傷指數(shù)。按Guth等［7］標(biāo)準(zhǔn)：斑點(diǎn)糜爛計(jì)1分；糜爛長(zhǎng)度＜1mm計(jì)2分；1mm～2mm計(jì)3分；2mm～4mm計(jì)4分；＞4mm計(jì)5分；若寬度＞1mm加倍得分。每個(gè)胃所得總分即為該鼠的胃黏膜損傷指數(shù)。

1.6 胃黏膜TNF－α的表達(dá)測(cè)定 采用SABC法行TNF－α免疫組化測(cè)定，胃黏膜上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)。隨機(jī)測(cè)試5個(gè)高倍視野，采用Image－pro plus圖像分析軟件進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野均值。判斷結(jié)果：①依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0計(jì)0分，≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。②依據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。③數(shù)量積分與著色強(qiáng)度積分相加，0分為（－），2分～3分為（±），4分～5分為（＋），6分～7分為（＋＋）。其中（－）和（±）判為陰性，（＋）和（＋＋）判為陽(yáng)性［8］。

1.7 血清TNF－α含量測(cè)定 采用雙抗夾心ELISΑ法檢測(cè)血清TNF－α含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述、方差分析、Kruskal－WallisH檢驗(yàn)、Nemenyi法進(jìn)行兩兩比較。采用Pearson、Kendall相關(guān)分析，α值界定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠術(shù)后存活狀況 大鼠胃缺血再灌注損傷術(shù)后10℃組、24℃組、32℃組、40℃組各有8只、9只、9只、7只存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.2 胃黏膜損傷指數(shù) 實(shí)驗(yàn)各組所有大鼠胃黏膜均可見(jiàn)不同程度的點(diǎn)狀、條索狀和片狀糜爛、潰瘍。10℃組胃黏膜損傷指數(shù)最低，40℃組最高，除24℃組與32℃組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其他各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。胃黏膜損傷指數(shù)與腸內(nèi)喂養(yǎng)溫度呈正相關(guān)（r＝0.689，P＜0.01）。

表1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較（±s）

表1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較（±s）

組別 只數(shù) 胃黏膜損傷指數(shù)10℃組 8 32.13±6.47 24℃組 9 40.11±7.831）4）32 ℃組 9 44.22±7.352）3）5）40℃組 7 52.14±8.862）

2.3 胃黏膜TNF－α免疫組化結(jié)果 各組大鼠胃組織TNF－α陽(yáng)性表達(dá)部位可見(jiàn)于整個(gè)黏膜層，但細(xì)胞著色強(qiáng)度有很大區(qū)別，詳見(jiàn)圖1。10℃組8只中有3只陽(yáng)性表達(dá)，24℃組9只中有7只陽(yáng)性表達(dá)，32℃組9只中有7只陽(yáng)性表達(dá)，40℃組全部有陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)表2。各組胃組織TNF－α表達(dá)強(qiáng)度比較，10℃組與24℃組、32℃組比較，P＜0.05；10℃組與40℃組比較，P＜0.01；24℃組與40℃組比較，P＜0.05；24℃組與32℃組、32℃組與40℃組比較，P＞0.05。且TNF－α陽(yáng)性表達(dá)程度與腸內(nèi)喂養(yǎng)溫度呈正相關(guān)（r＝0.507，P＜0.01）。

圖1 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃組織TNF－α陽(yáng)性表達(dá)（×200）

表2 實(shí)驗(yàn)各組大鼠胃組織TNF－α表達(dá)強(qiáng)度比較 只

2.4 血液 TNF－α的變化 10℃組、24℃組、32℃組、40℃組血液 TNF－α含量分別為（187.83±13.08）ng/L、（199.53±16.64）ng/L、（201.84±11.15）ng/L、（201.93±18.15）ng/L。各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

低溫治療在腦、心肌等多臟器缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用已得到廣泛證實(shí)。在低溫治療方法上，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)缺血局部低溫治療相比全身低溫治療，同樣展現(xiàn)出良好的治療效果，且副反應(yīng)更少，顯示出令人振奮的前景［3，9，10］。胃黏膜在遭受嚴(yán)重應(yīng)激源刺激時(shí)會(huì)發(fā)生不同程度的缺血再灌注（I－R）損傷，為了探討低溫腸內(nèi)喂養(yǎng)對(duì)缺血再灌注后對(duì)胃黏膜是否具有保護(hù)作用，本研究通過(guò)夾閉大鼠胃部供血血管造成胃缺血－再灌注損傷模型，模擬臨床病理生理狀態(tài)，將營(yíng)養(yǎng)液直接灌入胃內(nèi)，對(duì)比應(yīng)用不同溫度腸內(nèi)喂養(yǎng)液對(duì)胃缺血－再灌注損傷大鼠胃黏膜的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著喂養(yǎng)溫度的降低，胃黏膜損傷指數(shù)下降，提示10℃組低溫腸內(nèi)喂養(yǎng)液對(duì)大鼠胃缺血－再灌注損傷后胃黏膜具有保護(hù)作用。

有研究表明，機(jī)體在胃缺血－再灌注損傷后TNF－α明顯增加［1，2］。TNF－α是機(jī)體炎癥反應(yīng)中最早、發(fā)揮核心作用的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，是引起機(jī)體代謝和血液動(dòng)力性紊亂，促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)生成，導(dǎo)致炎癥因子“瀑布效應(yīng)”的元兇。TNF－α引起機(jī)體急性胃黏膜損傷，其機(jī)制可能為：①TNF－α誘導(dǎo)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素－1（IL－1）、白細(xì)胞介素－6（IL－6）、白細(xì)胞介素－8（IL－8）等炎癥因子的表達(dá)有關(guān)；②TNF－α參與中性粒細(xì)胞（PMN）的活化，細(xì)胞間黏附因子（ICAM）、血管細(xì)胞黏附因子（VCAM）等細(xì)胞黏附因子的激活，促使PMN黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促使其遷移至炎癥組織中；③TNF－α誘導(dǎo)氧化亞氮合成酶的產(chǎn)生，引起氧化亞氮大量釋放。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，10℃組TNF－α含量最低，表明低溫腸內(nèi)喂養(yǎng)抑制了機(jī)體胃黏膜過(guò)度的炎癥反應(yīng)水平，其可能原因?yàn)榈蜏赝ㄟ^(guò)阻斷TNF－α的產(chǎn)生，使IL－1、IL－6等炎癥介質(zhì)生成減少，減慢炎癥反應(yīng)速度，減少炎性介質(zhì)的瀑布樣效應(yīng)來(lái)發(fā)揮作用。同時(shí)，抑制PMN的聚集和激活，減輕對(duì)血管內(nèi)皮的損傷；抑制氧化亞氮的生成。但血液中TNF－α含量雖較其他各組有所降低，卻未表現(xiàn)出明顯差異，其原因可能為：①腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)直接作用于胃內(nèi)，導(dǎo)致胃黏膜TNF－α的改變可能比血液作用更為明顯；②大鼠胃缺血－再灌注損傷后血漿TNF－α雖然上升，但一般5d才達(dá)高峰［1］。

從上述結(jié)果來(lái)看，在再灌注2h開(kāi)始給予低溫腸內(nèi)喂養(yǎng)，到再灌注48h對(duì)大鼠胃黏膜具有保護(hù)效果，但低溫腸內(nèi)喂養(yǎng)持續(xù)時(shí)間以及耐受性、并發(fā)癥等安全性問(wèn)題還將有待進(jìn)一步證實(shí)。

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