神經營養素-3基因轉染小膠質細胞及其表達

張福杰，戚超，趙夏，邢明磊，畢昆巍，于騰波

(青島大學附屬醫院骨科，山東 青島 266003)

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神經營養素-3基因轉染小膠質細胞及其表達

張福杰，戚超，趙夏，邢明磊，畢昆巍，于騰波

(青島大學附屬醫院骨科，山東 青島 266003)

目的 用神經營養素-3(NT-3)基因轉染小膠質細胞并檢測其表達情況。方法 小膠質細胞分離純化后，分為非轉染組、空轉染組及轉染組，非轉染組小膠質細胞不經質粒轉染，空轉染組及轉染組分別將空質粒pcDNA3.1及真核重組質粒pcDNA3.1/NT-3轉染小膠質細胞。然后經過G418篩選后，采用RT-PCR方法檢測3組小膠質細胞中的NT-3 mRNA水平，酶聯免疫吸咐法(ELISA法)檢測各組細胞培養液的吸光度值及NT-3蛋白的濃度。結果 RT-PCR檢測顯示，轉染組可得到一250 bp的基因片段。ELISA法檢測顯示，轉染組細胞培養液的吸光度值明顯高于非轉染組及空轉染組，差異有顯著性(F=57.23，t=14.28、12.93，P<0.05)。轉染組細胞培養液NT-3蛋白濃度亦明顯高于非轉染組及空轉染組，差異有顯著性(F=49.56，t=15.32、11.47，P<0.05)。結論NT-3基因成功轉染小膠質細胞，并獲得高效表達。

神經營養素-3；轉染；小膠質細胞

神經營養素-3(NT-3)是神經營養素家族的重要一員，是一種相對分子質量較小的蛋白質，廣泛分布于中樞及外周神經系統，不僅在神經系統的發育和分化過程中起重要作用，而且對于損傷神經元的軸突再生和功能恢復起著至關重要的作用[1]。小膠質細胞是神經膠質細胞的一種，它相當于中樞神經系統的巨噬細胞，在中樞神經系統損傷或炎癥時增殖并聚集于受損部位，發揮神經保護和神經損傷的雙重作用[2]。本實驗通過脂質體介導真核重組質粒轉染小膠質細胞的方式將NT-3基因轉入小膠質細胞，并檢測小膠質細胞中NT-3基因的表達水平，為將來轉基因小膠質細胞應用于脊髓損傷治療的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

妊娠Fisher大鼠(青島市藥檢所)，真核重組質粒pcDNA3.1/NT-3(北京賽百盛生物工程公司)，細胞培養基、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，胰蛋白酶、G418(Sigma公司)。

1.2實驗方法

1.2.1小膠質細胞的分離、培養、純化 取妊娠Fisher大鼠，無菌條件下取出胚胎，在解剖顯微鏡下將胚鼠顱骨剝去，完整取出胎腦，去除腦膜和血管，用PBS緩沖液沖洗后剪去腦干，僅留大腦半球和大腦(胼胝體予以保留)。腦組織轉移至小瓶中剪碎，反復輕柔吹打，經胰酶消化后將濾液注于離心管，加入DMEM/F12完全培養液終止消化，離心10 min棄去上清液，沉淀物靜置30 min，以差速貼壁去除成纖維細胞。吸取細胞懸液20 mL，接種于細胞培養瓶中，置于37 ℃、體積分數0.05 CO2條件下培養24 h。用D-Hanks溶液配制鹽酸利多卡因注射液至濃度為12 mmol/L，調整pH至7.3待用。吸除混合膠質細胞培養瓶中的培養液，加入已配制的鹽酸利多卡因溶液，繼續培養10 min，輕輕搖晃2 min，顯微鏡下觀察見大量細胞懸浮后，離心收集細胞。將收集的細胞接種于培養瓶中，置于37 ℃、體積分數0.05 CO2條件下繼續培養至第2天，完全換液一次，去除未貼壁的細胞，即獲得純化的小膠質細胞。

1.2.2脂質體Lipofectamine 2000介導NT-3轉染小膠質細胞 將分離純化的小膠質細胞經胰酶消化后，重懸于培養液中，調整細胞密度為1×108/L。取2 mL轉種于培養皿中，在37 ℃、體積分數0.05的CO2條件下培養24 h后，細胞融合達到80%。將4 μg重組質粒pcDNA3.1/NT-3及10 μL脂質體Lipofectamine 2000分別加入至250 mL的Opti-MEM培養基中，獲得溶液A、B。將A、B液混勻后置于室溫下 20 min，將用PBS緩沖液再次洗滌的細胞均勻滴加于細胞培養基中，輕輕混勻，在37 ℃、體積分數0.05的CO2條件下培養24 h。用G418對培養液進行篩選，每4 d換液一次，共篩選3次。存活細胞培養、增殖后進行檢測。以未經質粒轉染的小膠質細胞(非轉染組)及空質粒pcDNA3.1轉染的小膠質細胞(空轉染組)作為對照。

1.3檢測指標及方法

1.3.1小膠質細胞NT-3 mRNA水平檢測 采用逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)方法。提取重組質粒pcDNA3.1/NT-3轉染后的小膠質細胞(轉染組)總mRNA，用Invitrogen試劑盒進行RT-PCR，94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃延伸5 min。以同樣的方法測定非轉染組及空轉染組的NT-3 mRNA水平。

1.3.2NT-3蛋白的分泌情況檢測 采用酶聯免疫吸咐法(ELISA法)。3組小膠質細胞用胰酶消化后，按每個培養皿5×105個細胞的標準分別接種到8個培養皿中，分別加入細胞培養液2 mL，然后在37 ℃、體積分數0.05的CO2條件下培養24 h。取3組細胞培養液，用ELISA檢測儀測定吸光度值及NT-3蛋白濃度。

1.4統計學方法

2 結 果

2.1各組小膠質細胞NT-3 mRNA水平比較

RT-PCR結果顯示，轉染組NT-3 mRNA表達呈陽性，可擴增得到一約250 bp的條帶，而非轉染組和空轉染組NT-3 mRNA表達呈陰性(圖1)。

M：Marker；A、B、C分別為非轉染組、空轉染組及轉染組β-actin；D：非轉染組小膠質細胞NT-3 mRNA；E：空轉染組小膠質細胞NT-3 mRNA；F：轉染組小膠質細胞NT-3 mRNA。

2.2各組細胞培養液中NT-3蛋白的分泌情況

ELISA檢測結果顯示，非轉染組、空轉染組及轉染組小膠質細胞培養液的吸光度值分別為0.59±0.02、0.60±0.03、2.49±0.09，轉染組高于非轉染組與空轉染組，差異有顯著意義(F=57.23，t=14.28、12.93，P<0.05)；非轉染組和空轉染組之間比較差異無顯著性(t=1.12,P>0.05)。3組細胞培養液的NT-3蛋白濃度分別為(3.93±0.35)、(4.12±0.27)、(15.56±1.05)ng/L，非轉染組和空轉染組之間比較差異無顯著性(t=1.56,P>0.05)；轉染組高于非轉染組與空轉染組，差異有顯著性(F=49.56，t=15.32、11.47，P<0.05)。

3 討 論

脊髓損傷是中樞神經系統的一種嚴重創傷，給家庭和社會造成巨大的精神和經濟負擔[3]。脊髓損傷后的功能修復一直是醫學界的難題，目前人們也在致力于尋求有效的治療方法攻克這一難題。脊髓損傷后的病理改變有神經元損傷、軸突中斷及出血等，近年來研究顯示脊髓損傷后功能恢復差的一個重要原因就是神經營養因子缺乏，而其中NT-3的缺乏是一個不可忽視的因素。

NT-3是中樞及外周神經系統神經元發育、分化、存活和再生的重要營養因子。NT-3分泌后能通過p75NTR和Trks受體激活其下游信號通路，促進軸突生長和血管再生，因此，NT-3在脊髓損傷后的功能恢復方面發揮重要作用[4]。WEISHAUPT等[5]研究結果顯示，脊髓損傷后NT-3基因表達明顯增加，從而有利于脊髓損傷的修復。NT-3可刺激神經前體細胞分化為新的神經元，并促進神經元的存活，還可通過提高細胞Ca2+平衡能力和自由基清除能力，減輕局部缺血及自由基造成的神經元損傷。ZHANG等[6]研究表明，NT-3可以通過抵御中樞神經系統的缺血性或再灌注性損傷，發揮神經系統的保護作用。

小膠質細胞是中樞神經系統重要的免疫細胞，生理條件下處于靜止狀態，當中樞神經系統受到損傷時，小膠質細胞可經過多種信號途徑，如PTK途徑、PLA2途徑、MAPK超家族的信號轉導途徑被迅速激活，引發T細胞介導的免疫反應，同時發揮巨噬細胞的吞噬作用，參與炎癥、損傷等病理過程。它可以吞噬壞死的細胞及髓鞘，滅活細胞裂解后釋放的毒性物質，為神經元提供一個相對適合的微環境，促進組織修復。小膠質細胞在激活T淋巴細胞同時，還可激活中性粒細胞及其他神經膠質細胞，促進細胞因子和生長因子的分泌，從而有利于中樞神經系統損傷組織的再生[7]。于騰波等[8]研究證明，小膠質細胞移植可以促進脊髓損傷大鼠后肢運動功能的恢復。

目前，脊髓損傷治療的研究中，基因修飾的細胞移植漸成主流。WANG等[9]報道，NT-3基因修飾的骨髓間充質干細胞移植可促進脊髓功能的恢復。施新革等[10]應用陽離子脂質體介導NT-3轉染大鼠雪旺細胞，結果顯示NT-3基因成功轉染雪旺細胞并高效表達。因此，本文嘗試將NT-3基因轉入小膠質細胞，研究其在小膠質細胞中的表達情況。

本實驗RT-PCR結果顯示，轉染組小膠質細胞NT-3 mRNA水平明顯升高，表明轉染組小膠質細胞NT-3基因在轉錄水平上獲得良好表達；ELISA法結果顯示，轉染組細胞培養液吸光度值及NT-3蛋白濃度顯著增加，表明轉染組小膠質細胞可高效表達NT-3蛋白。本實驗從基因轉錄及翻譯水平上檢測NT-3基因的表達情況，結果更準確可靠。

綜上所述，NT-3基因成功轉染小膠質細胞，并獲得了高效表達，從而為進一步將NT-3基因修飾的小膠質細胞應用于脊髓損傷的治療提供了實驗依據。但是，NT-3基因修飾的小膠質細胞移植到脊髓損傷部位后，對受損脊髓功能恢復的作用還需要進一步的研究。

[1] LYKISSAS M G, BATISTATOU A K, CHARALABOPOULOS K A, et al. The role of neurotrophins in axonal growth, guidance, and regeneration[J]. Current Neurovascular Research, 2007,4(2):143-151.

[2] 安海勇,程光,白俊清. 小膠質細胞在中樞神經系統損傷作用機制的研究進展[J]. 中國醫藥導報, 2013,10(9):31-33,39.

[3] 孫中儀,陳伯華,胡有谷,等. 中國脊柱脊髓損傷數據庫對急性脊髓損傷病人的分析價值[J]. 青島大學醫學院學報, 2012,48(2):115-117.

[4] 張冉,龍雙漣. 神經營養素-3及其在脊髓損傷修復中的作用[J]. 中南醫學科學雜志, 2013,41(2):196-200,210.

[5] WEISHAUPT N, MASON A L, HURD C, et al. Vector-induced NT-3 expression in rats promotes collateral growth of injured corticospinal tract axons far rostral to a spinal cord injury[J]. Neuroscience, 2014,272:65-75.

[6] ZHANG J, SHI Q, YANG P, et al. Neuroprotection of neurotrophin-3 against focal cerebral ischemia/reperfusion injury is regulated by hypoxia-responsive element in rats[J]. Neuroscience, 2012,222:1-9.

[7] LOANE D J, BYRNES K R. Role of microglia in neurotrauma[J]. Neurotherapeutics: the Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, 2010,7(4):366-377.

[8] 于騰波,寇德偉,程永帥,等. 活化小膠質細胞移植治療大鼠脊髓損傷的療效初探[J]. 中華創傷雜志, 2008,24(5):373-377.

[9] WANG L J, ZHANG R P, LI J D. Transplantation of neurotrophin-3-expressing bone mesenchymal stem cells improves recovery in a rat model of spinal cord injury[J]. Acta Neurochirurgica, 2014,156(7):1409-1418.

[10]施新革,宗海斌,董玉珍,等. 陽離子脂質體介導神經營養因子-3在大鼠雪旺細胞中的表達[J]. 軍醫進修學院學報, 2011,32(9):956-958,964.

(本文編輯 黃建鄉)

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TANSFECTION OF NEUROTROPHIN-3 GENE TO MICROGLIA AND ITS EXPRESSION

ZHANGFujie,QIChao,ZHAOXia,XINGMinglei,BIKunwei,YUTengbo

(Department of Orthopedics, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo transfect neurotrophin-3 (NT-3) gene into microglia and test its expression.MethodsMicroglia were separated, purified and randomized to three groups as non-transfection group, empty-transfection group, transfection group. In non-transfection group, the microglia were not transfected by plasmid, and in empty-transfection group and transfection group, pcDNA3.1 and pcDNA3.1/NT-3 were transfected to microglia, respectively. After G418 screening, the level of NT-3 mRNA in microglia in the three groups was detected using RT-PCR, and the absorbance and NT-3 protein concentration in each group were measured employing enzyme-linked immunoassay sensitive assay (ELISA).ResultsRT-PCR showed a 250 bp segment obtained in the transfection group. ELISA showed that the absorbance in the cell culture fluid in transfection group was higher than that in both non-transfection and empty-transfection groups (F=57.23;t=14.28,12.93;P<0.05), and NT-3 protein concentration was also higher (F=49.56;t=15.32,11.47;P<0.05).ConclusionNT-3 gene was successfully transfected to microglia, and obtained efficient expression.

neurotrophin-3; transfection; microglia

2015-04-29;

2015-08-26

青島市民生計劃項目(13-1-3-26-nsh)

張福杰(1990-)，男，碩士研究生。

于騰波(1970-)，男，博士，主任醫師，博士生導師。

Q784

A

1008-0341(2015)06-0661-03