實時定量PCR法分析2型糖尿病患者腸道乳酸桿菌菌種數量改變分析

徐東明 ,張馳,張希泉,趙洪霞

1.哈爾濱鐵路疾病預防控制中心,黑龍江哈爾濱 150081;2.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江佳木斯 154002

正常人體中的腸道中,分布有多種益生菌、條件致菌病和少數致病菌,這些病菌能夠發揮拮抗病原微生物定植、刺激機體免疫機制等的作用,進而維持腸道的正常結構和生理機能。腸道菌群如果失調,就可能引起一系列的腸外疾病,2型糖尿病、肥胖等都是腸道菌群失調可能誘發的疾病[1]。該研究就該院收治的2型糖尿病患者作為研究對象,通過實時定量PCR法對其腸道乳酸桿菌菌種數量的變化進行分析,并探討其對患者的血糖、血脂代謝的影響。具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在該院收治的2型糖尿病患者100例作為研究對象,所有患者均符合世界衛生組織制定的糖尿病診斷標準。排除標準[2]：合并肝腎功能損傷的患者；合并甲狀腺疾病及其他內分泌疾病的患者；合并腫瘤的患者；近期(4周內)有使用胃腸道相關治療藥物或者抗生素、微生態制劑的患者；近3個月內有使用降脂藥物的患者。其中,男性患者52例,女性患者48例,其年齡在35~78歲之間,平均年齡為(57.9±3.3)歲。

選擇同期在該院接受健康體檢的正常人100例作為研究對象,男女各50例,年齡在33～78歲之間,平均年齡為(56.2±3.6)歲。

表1 兩組實驗者血糖、血脂水平的比較(x-±s)

表2 兩組實驗者總乳酸桿菌及具體菌屬的數量比較(Xlgx± Slgx拷貝數/克濕便)

兩組實驗者的性別、年齡等方面的比較均差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

采集兩組實驗者的空腹血液標本和餐后2 h血液標本,分別對其空腹血糖值、糖化血紅蛋白水平、血脂相關指標(血清總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白以及甘油三酯等)以及餐后2 h血糖值等指標進行測定和比較。

采集實驗者的糞便樣品,保存在零下70 ℃的環境中,對其進行預處理和細菌總DNA提取。稱取濕重糞便樣品,加滅菌PBS振蕩混合后做離心處理,采集上清液(菌體)并反復洗滌后再次離心,收集沉淀中的菌體,以滅菌PBS懸浮,離心并多次洗滌后保存獲得的菌體沉淀。嚴格按照細菌基因組DNA提取試劑盒上的操作要求對菌體沉淀中的細菌總DNA進行提取,行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析后將細菌DNA溶液置于零下20 ℃的條件下保存。

參照文獻[3],根據乳酸桿菌菌種的16s rRNA基因序列,設計特異性PCR引物。將標準菌株的PCR產物依次進行切膠和回收處理后得到的DNA片段作為熒光定量PCR的標準品,計算并制作標準曲線,再根據10倍系列稀釋的標準品反應時的熒光擴增信號,獲取乳酸桿菌菌種的標準曲線。將提取到糞便樣品DNA分別進行乳酸桿菌總屬及其具體菌種16s rRNA熒光定量PCR反應,反應體系、條件等一致。將糞便細菌的DNA樣品和10倍系列稀釋的標準品同時做實時PCR反應,每個樣品做2個平行復孔,在反應結束之后通過融解曲線的分析判斷PCR產物的特異性,并計算單位量糞便樣品中待測細菌基因的拷貝數。

1.3 統計方法

該次實驗數據采用SPSS19.0軟件進行統計學分析,其中計量資料對比采用t檢驗,計數資料對比采用c2檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

比較糖尿病患者和健康志愿者的血糖、血脂等主要觀察指標的區別,可見糖尿病患者各項指標均顯著高于健康志愿者,比較差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

比較糖尿病患者和健康志愿者的乳酸桿菌菌屬及具體菌種的數量,可見除植物乳桿菌外,總乳酸桿菌及嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌的比較,兩組實驗者均差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

對乳酸桿菌數量與血糖、血脂各項指標之間的關系進行分析,可見其與血脂各項指標均成負相關,但與低密度脂蛋白膽固醇之間的相關性,差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

作為腸道中普遍存在益生菌,乳酸桿菌包括了嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等多種菌種,其在維持腸道正常結構和生理機能上發揮重要作用,但對人體代謝機制的影響并不十分清晰。

實時定量PCR法能對目標細菌16s rRNA V3區序列設計特異性引物,并通過熒光定量PCR擴增技術檢測樣本,特異性高。該文經實時定量PCR法對2型糖尿病患者和健康志愿者腸道內的乳酸桿菌菌種數量進行了測定和比較,結果可見2型糖尿病患者的總乳酸桿菌以及嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等具體菌種的數量均顯著增加,與正常人比差異有統計學意義,而將其與實驗者的血糖、血脂水平進行相關性分析,則可見其改變與血脂水平呈負相關,提示長期高脂飲食可能是造成腸道菌群失調,代謝紊亂,誘發2型糖尿病的原因之一。腸道菌群無法正常轉化不溶性糖類和蛋白質而將葡萄糖分解為乳酸,參與膽固醇代謝,進而導致2型糖尿病。這也提示在對患者進行治療的時候可以通過飲食調節乳酸桿菌菌種數量改善患者的血糖、血脂代謝失調。

[1] 宋美茹,姚萍. 應用實時熒光定量 PCR 定量檢測潰瘍性結腸炎腸道大腸埃希菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌屬的變化[J].中國微生態學雜志,2012,24(3):239-241.

[2] 唐源淋,張紹衡,郭亞兵,等. 兩種方法定量分析肝硬化患者腸道菌群改變的比較[J]. 現代消化及介入診療,2012,17(1):5-7.

[3] 劉婷婷, 蔡德鴻. 實時定量PCR法分析2型糖尿病患者腸道乳酸桿菌菌種數量的改變[J]. 世界華人消化雜志,2012,20(15):1359-1362.