湖南老年醫院首例恙蟲病多器官受累病例實驗室分析

朱黎明，王 勇，黃 進，戴愛國，羅 曼，胡 芳，張麗娟

湖南老年醫院首例恙蟲病多器官受累病例實驗室分析

朱黎明1，王 勇2,3，黃 進1，戴愛國1，羅 曼1，胡 芳1，張麗娟2

目的 對湖南老年醫院首例恙蟲病可疑病例進行實驗室快速診斷及病原分子流行病學分析。方法 病人急性期及恢復期血清恙蟲病IgM、IgG抗體進行膠體金快速定性及ELISA定量。環介導等溫擴增(LAMP)病人血液及焦痂恙蟲病東方體56KD 基因及巢氏PCR擴增熱休克蛋白基因(groEL)并分析groEL遺傳進化關系。結果 病人發熱期(發病24天)及恢復期(發病32天)血清IgM、IgG抗體定性試驗均為陽性，ELISA定量試驗雙份血清IgM、IgG抗體滴度均達1∶2 560。急性期血液及焦痂DNA樣本LAMP檢測及巢氏PCR擴增groE陽性。結論 本報道為湖南老年醫院首例恙蟲病病例報道。應加強立克次體病診斷及鑒別診斷。

恙蟲病;恙蟲病東方體;多器官受累;實驗室調查

XinjiangProvince,People’sRepublicofChina)

恙蟲病(scrub typhus)是嚴重威脅亞太平洋地區公共衛生健康的媒介源性立克次體病[1-2]。臨床以高熱、蟲媒叮咬焦痂或潰瘍、淋巴結腫大及皮疹為特征[3-4]。該病易誤診，導致多器官衰竭，甚至死亡[5-6]。1986年前，恙蟲病主要分布我國長江以南，此后，北方多地報道該病流行及臨床病例[7-9]。本文就湖南老年醫院首例恙蟲病臨床診斷病例實驗室快速診斷作以報告。

1 病例調查及標本采集患者

2014年10月20日，男性,以發熱、頭痛、伴嘔吐入院。52歲,江華瑤族自治縣人。入院系統檢查顯示多器官損傷。實驗室檢查WBC升高、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿酸、乳酸脫氫酶、C反應蛋白及血沉均表現升高。常見的發熱性感染性疾病包括病毒類感染、細菌性感染實驗室檢測均為陰性。常規抗病毒、抗細菌、抗真菌治療無效。因病人曾有野外活動史，查體顯示陰囊下有蟲咬焦痂。考慮恙蟲病并給予多西環素治療，2 d后發熱停止，實驗室各項指標恢復正常出院。病人發熱期10月31日間采集第一份血液標本并分離血清及血塊-20 ℃保存，同時采集焦痂組織標本。11月10日采集恢復期標本分離血清并送中國CDC傳染病所無形體室進行檢測。

2 實驗室檢測分析

2.1 血清學檢測 發熱期及恢復期血清標本同時檢測恙蟲病東方體IgM和IgG抗體。快速定性檢測使用美國InBios國際有限公司快速膠體金診斷試劑(scrub typhus detectTMIgG, LOT#:NB 46/80; scrub typhus detectTMIgM, LOT#:46/81。定量試驗使用同公司ELISA診斷試劑盒(scrub typhus detectTMIgM ELISA, LOT#:PD 1173; scrub typhus detectTMIgG ELISA, LOT#:STGS-1)。

2.2 環介導等溫擴增(LAMP)恙蟲病東方體56 KD蛋白基因 發熱期、恢復期血塊及焦痂組織DNA提取使用德國QIAGEN公司DNA提取試劑盒(Cat. No. 69506)。正常人血液及無菌水同時操作作為陰性對照；恙蟲病東方體kato型(WHO立克次體協作中心惠贈)DNA作為陽性對照。LAMP引物：FIP(5′- GTCACCGCAACATTTGCATCTG-GTAACACTGCAGGTGTGAT-3′)，BIP(5′- TACAGCAATTGAAGCATCAGGT-TCCTAAACGTAACTCGGC-3′)，F3(5′- TGCCRTT

TTCAGCTAGTG-3′)，B3(5′- TKGMGCRATTGTCATACC-3′)，LB(5′- AACRCTTGYCATTAACAACCGG-3′)。LAMP總反應體積 25 μL包含有1.6 μmol/L FIP 和BIP引物, 0.8 μmol/L LF和LB 引物, 0.2 μmol/L F3和B3引物, 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),10 mmol/L KCl,8 mmol/L MgSO4, 10 mmol/L(NH4)2SO4, 0.1% 土溫-20, 0.8 mol/L甜菜堿, 1.4 mmol/L dNTP和1 μLBstDNA聚合酶 (8 U/μL)。反應在LAMP實時濁度儀(model LA200, Teramecs, Tokyo, Japan) 63 ℃恒溫下作用 60 min， 然后 80 ℃作用5 min。 反應產物以2% 瓊脂糖凝膠電泳。所有標本獨立平行操作2次。

2.3 PCR擴增熱休克蛋白groEL基因及序列分析 巢式PCR檢測血快及焦痂組織恙蟲病東方體groEL基因[10]。外引物Gro-1：5′- AAG AAG GA/CGT GAT AAC-3′；外引物Gro-2：5′-ACT TCA/CGT AGC ACC-3′；內引物TF-1：5′-ATA TAT CAC AGT ACT TTG CAA C-3′；內引物TR-2：5′-GTT CCT AAC TTA GAT GTA TCA T-3′。反應體系及PCR反應條件按文獻進行[10]。預期片段為364 bp。產物送北京擎科新業生物技術有限公司雙向測序。應用Blast平臺，將所測序列同源比較并用Mega5.0軟件構建進化樹。

3 結 果

3.1 血清學 發熱期及恢復期血清膠體金定性檢測IgM和IgG抗體均陽性。ELISA定量檢測上IgM和IgG抗體滴度均為1∶2 560。

3.2 LAMP檢測 獨立平行2次LAMP檢測發熱期及及恢復期血塊及焦痂標本,結果顯示發熱期血塊、焦痂組織呈陽性，而恢復期血塊陰性(圖1)。

M:DNA標準；泳道1：發熱期血塊，泳道2：恢復期血塊，泳道3：焦痂組織，泳道4：陽性對照，泳道5：陰性對照。

圖1 LAMP檢測結果

Fig.1 LAMP results of patient’s blood DNA and eschar DNA

3.3groEl基因擴增及序列分析 病人發熱期及焦痂組織groEl基因擴增陽性，并且2種標本檢出序列100%同源(328 bp)。而恢復期血液標本檢測陰性。檢出序列暫命名為Hunan1。Blast同源比較及進化分析發現本試驗檢出序列與泰國UT125株，Gilliam型(EF551293)，2049株，Gilliam型(EF551291)[11]、日本福島02株(KC688330)及埼玉市捕捉的大林姬鼠(Apodemusspeciosus)UAP2株(KC688329)檢出序列[12]100%同源(圖2)。此外，與我國近年北方地區如北京郊區家畜動物山羊BJ-MY-OT-S49株(GQ499948)、家犬BJ-TZ-OT-D57株(GQ499950)、牛BJ-TZ-OT-O30株(GQ499951)及BJ-TZ-OT-O31(GQ499952)、中部安徽地區山羊AH-GD-OT-S5株(GQ499933)；AH-GD-OT-23株(GQ499934)；AH-GD-OT-22株(GQ499935)、浙江發熱病人Jin-2012株(KC485338)及Zhou-2012株(KC485340)及該地區牛ZJ-TT-OT～O21株(GQ499953)遺傳關系密切，同源性99%。同時，泰國病人UT76株(EF551292)、UT169株(EF551297)、UT219株(EF551302)、UT302株(EF551304)、UT336株(551307)、UT395株(EF551309)、UT418株(EF551310)[11]、日本Kato型分離株(AY151986)及日本大林姬鼠SH205株(KC688302)及SH245株(KC688334)[12]也歸為該基因簇。然而，本試驗檢出序列與安徽阜陽病人FY1株(GQ468797)及北京病人BJ-PG-2008株(GQ894502)[9]遺傳關系較遠(圖2)，后者與日本新發Kawasaki型[12](AY191587)、南朝鮮Boryong株(AM494475)遺傳關系密切。

圖2 病原體 groEL基因進化分析

Fig.2 Phylogentic analysis based on theO.tsutsugamushigroELgene tested in the study

4 討 論

恙蟲病是嚴重威脅我國公共衛生的重要媒介傳染病,尤其我國農業人群存在較高的暴露風險。隨著全球氣候變化，我國恙蟲病流行疫區逐漸擴大到全國范圍。本實驗通過快速血清學及分子生物學診斷技術對臨床診斷病例進行實驗室明確診斷。并通過序列分析確定了感染病原體的血清型為Gilliam型，這一型別在我國多地病人、家畜動物、嚙齒動物、恙螨、周邊國家如泰國、日本、緬甸等國均有報道[1,4-5]。本病例是該院首例恙蟲病報告病例，提示加強立克次體病診斷及鑒別診斷，盡可能降低多器官衰竭及病死率的發生，對當地發熱病人的救治具有重要的臨床意義。

[1]Yu NS. Chinese zoonoses[M]. Fujian: Fujian Science and Technology Publishing House, 1996: 481-502. (in Chinese) 于恩庶. 中國人獸共患病學[M].福建:福建科學技術出版社,1996:481-502.

[2]Yu DZ. Zoonotic infectious diseases[M]. Beijing: Science Publishing House, 2009: 644-656. (in Chinese) 俞東征.人獸共患傳染病學[M].北京:科學出版社,2009:644-656.

[3]Zhang LJ, Xu JG. Contemporary state of rickettsiology and rickettsioses[M]. Changchun: Jilin University Publishing House, 2010，67-175. (in Chinese) 張麗娟，徐建國.當代立克次體學與立克次體病[M].長春:吉林大學出版社，2010，67-175.

[4]Zhang LJ, Fu XP, Fan MY. Rickettsial research and epidemiological satus of ricketstsioses in China[J]. J Trop Dis Parasitol. 2005, 3(1): 37-42. (in Chinese) 張麗娟，付秀萍，范明遠.我國立克次體研究與立克次體病的流行現狀[J].熱帶病與寄生蟲學,2005:3(1):37-42.

[5]Wen XT, Yu NS, Xu JG, et al. Contemporary zoonology[M]. Chengdu: Sichuan Science and Technology Publishing House, 2011: 873-895. (in Chinese) 文心田, 于恩庶,徐建國,等.當代世界人獸共患病學[M].成都: 四川科學技術出版社, 2011: 873-895.

[6]Xu JG. Field bacteriology[M]. Beijing: Science Publishing House, 2011: 610-619. (in Chinese) 徐建國.現場細菌學[M].北京:科學出版社,2011:610-619.

[7]Zheng L, Yang H, Bi Z,et al. Epidemic characteristics and spatio-temporal patterns of scrub typhus during 2006-2013 in Tai’an, Northern China[J]. Epidemiol Infect, 2014, 29: 1-8

[8]Zhang WY, Wang LY, Ding F,et al. Scrub typhus in mainland China, 2006-2012: the need for targeted public health interventions[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 26, 7(12): e2493. DOI:10.1371/journal.pntd.0002493

[9]Li W, Dou X, Zhang L,et al. Laboratory diagnosis and genotype identification of scrub typhus from Pinggu district, Beijing, 2008 and 2010[J]. Am J Trop Med Hyg, 2013, 89(1): 123-129. DOI:10.4269/ajtmh.12-0728

[10]Fu XP, Zhang JS, Shen XJ, et al. Surveillance on rickettsia in epidemic areas of scrub typhus in Xinyang areas of Henan Province[J]. Chin J Epidemiol, 2007, 28(6): 547-549. (in Chinese) 付秀萍，張景山，申曉靖，等. 河南省信陽地區鼠類感染立克次體的調查[J]. 中華流行病學雜志，2007，28(6)：547-549.

[11]Paris DH, Aukkanit N, Jenjaroen K, et al. A highly sensitive quantitative real-time PCR assay based on thegroELgene of contemporary Thai strains ofOrientiatsutsugamushi[J]. Clin Microbiol Infect, 2009,15(5):488-495. DOI:10.1111/j.1469-0691.2008.02671.x

[12]Arai S, Tabara K, Yamamoto N, et al. Molecular phylogenetic analysis ofOrientiatsutsugamushibased on thegroESandgroELGenes[J]. Vector Borne Zoonotic Dis, 2013, 13(11): 825-829. DOI:10.1089/vbz.2012.1155

Laboratory investigation of the first scrub typhus case with multiorgan dysfunction in Hunnan Geriatric Hospital

ZHU Li-ming1,WANG Yong2,3，HUANG Jin1,DAI Ai-guo1,LUO Man1,HU Fang1,ZHANG Li-juan2

(1.DepartmentofGeriatricsRespiratoryMedicine,HunanGeriatricHospital410016,China;2.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China；3.CollegeofAnimalScience&Technology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,

To laboratory confirm of a clinical suspected scrub typhus with multiorgan failure in Hunnan Geriatrichospital and understand the molecular epidemiological characterizes of the pathogen tested in the study. Paired sera from the acute(24 days after onset of illness)and convalescence (32 days after illness)were tested for IgM and IgG antibodies againstOrientiatsutsugamushiby a gold conjugate-based rapid diagnostic test (RDT)and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),respectively. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) targeting the 56KD protein gene ofO.tsutsugamushiand the nested PCR targeting thegroELgene were performed respectively as the blood DNAs and the eschar DNA as temples. The IgM and IgG againstO.tsutsugamushifor sera from acute and convalescence stages were positive by RDT and the highest titer of IgM and IgGwere detected in 1∶2 560 for both of acute and convalescence stages sera. LAMP and nested PCR proved to be positive for theDNAs from acute stage blood and eschar tissue respectively.

scrub typhus;Orientiatsutsugamushi; multiorgan dysfunction; Laboratory investigation

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.019

“十二五”傳染病重大專項課題(No.2012ZX10004215; No.2011ZX10004-001);國家基礎研究項目(973計劃)(No.2010CB530206)聯合資助,朱黎明、王勇同等貢獻

張麗娟， Email:zhanglijuan@icdc.cn

1.湖南老年醫院,長沙 410016; 2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,北京 102206; 3.新疆石河子大學,石河子 832003

The work was supported by the National Key Science and Technology Projects of China (No.2012ZX10004215 and 2011ZX10004-001) and the National Basic Research Program of China (973 Program- 2010CB530206).

R376

B

1002-2694(2015)08-0775-03

2015-01-14；

2015-04-22