貓用高效狂犬病滅活疫苗研究

張 菲，何 娜，王 穎，劉 曄，張守峰，扈榮良

貓用高效狂犬病滅活疫苗研究

張 菲，何 娜，王 穎，劉 曄，張守峰，扈榮良

目的 研制水包油新型佐劑狂犬病疫苗開展貓的免疫試驗。方法 利用BHK-21細胞培養狂犬病病毒鼬獾源性JX04-45株，病毒滴度達到107.5TCID50/mL以上的病毒培養物用于滅活和疫苗制備，佐劑為新型水包油型；通過本實驗室建立的熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)測定疫苗效力和貓免疫后的中和抗體，并進行了攻毒試驗，評價本疫苗免疫效果。結果 一個劑量的疫苗免疫小鼠后FAVN方法測定的疫苗效力≥3.0 IU/劑量；水包油佐劑型狂犬病滅活疫苗免疫貓后14 d時無不良反應，FAVN測得其誘導的中和抗體水平平均達16.04±4.29 IU/mL，28 d平均達37.13±6.12 IU/mL，56 d為21.01±7.61 IU/mL。180 d為6.71±3.44 IU/mL，360 d為2.66±2.01 IU/mL。至15個月時，咬肌攻毒106MIC LD50狂犬病病毒BD06株，觀察90 d試驗組無一死亡，對照組全部死亡。結論 本疫苗誘導長達1年的免疫保護，可擴大安全評價和臨床試驗，以驗證其實用價值。

狂犬病；滅活疫苗；貓；中和抗體；攻毒試驗

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus)感染引起的一種以腦脊髓炎為主要病理特征、感染后100%死亡的人獸共患傳染病[1-3]。

犬引起的人的狂犬病在我國人狂犬病病例中平均約占95%，是人狂犬病的主要傳播宿主[4]，但針對犬的狂犬病疫苗我國已批準了5種以上滅活疫苗產品，另有4種進口產品和2種弱毒疫苗[5]，因此犬的狂犬病疫苗基本上可以滿足我國犬免疫的需求。貓引起的人的狂犬病在我國不同地區所占比例為1%～9%不等，因此貓也是人狂犬病的重要傳播宿主之一。但在我國批準的狂犬病弱毒疫苗和滅活疫苗中，針對貓的產品只有1種，且迄今未見正式生產和銷售。為此本實驗室利用分離的JX04-45株制備了一種水包油佐劑狂犬病滅活疫苗，并開展在貓的免疫試驗，取得良好的效果。

1 材料與方法

1.1 病毒株 用于狂犬病滅活疫苗制備的毒株為分離自鼬獾的JX04-45株[6]，在BHK-21細胞上增殖；用于攻毒用的強毒株為BD06，分離自河北保定的一只瘋犬，在犬腦內傳代；用于中和抗體測定的毒株為CVS-11，在BHK-21細胞上增殖。

1.2 細胞 用于病毒增殖的細胞為乳倉鼠腎傳代系BHK-21，培養基為含有2%血清、100 IU青霉素/mL、100 μg鏈霉素/mL、pH7.2的MEM(Invitrogen)。

1.3 動物 2～3 kg的家貓20只，購自長春市某養殖中心，熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)檢測貓的血清顯示，所有貓體內均沒有狂犬病中和抗體。16～20 g昆明鼠20只，購自長春生物制品研究所。狂犬病標準疫苗(11.6 IU/支)和標準血清(13.1 IU/mL)購自EDQM。

1.4 狂犬病滅活疫苗的制備 將JX04-45毒種按5%比例接種于BHK-21細胞上，于37 ℃培養至96 h，凍融2次后，按常規方法測定其半數細胞感染量(TCID50)。將107.5TCID50/mL以上的病毒培養物混合后，加入1/4 000的β-丙內酯，4 ℃滅活24 h，37 ℃水浴中水解2 h，按1∶2的比例將特制的水包油佐劑加入滅活的病毒液中混勻，1.1 mL/瓶分裝，2～8 ℃保存備用。

1.5 FAVN方法 利用本實驗室前期獲得的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體2株，采用常規方法制備異硫氰酸熒光黃標記熒光抗體[7]。利用狂犬病毒滅活疫苗免疫犬1次，14 d后采集血清，制備抗狂犬病毒血清，并以OIE標準品進行標定，參考OIE指定方法，確定中和試驗程序。其中血清加入量減少為50 μL，樣品檢測設置2個重復。

1.6 疫苗效力測定 采用免疫小鼠-血清測定的方法：將20只約16 g的昆明小鼠隨機分成2組，采用胰島素注射器吸取待測疫苗50 μL，于后肢肌肉注射途徑接種，正常飼養至14 d時，摘除眼球，吸取小鼠血液，分離血清。

通過修飾的FAVN法測定各小鼠血清中的狂犬病中和抗體水平，修飾的FAVN方法主要不同在于：(1)血清加樣時每個樣品采用2個重復，減少一倍；(2)血清樣品用量50 μL，減少1倍；(3)FITC標記抗體均為抗核蛋白單克隆抗體。測定出結果后，取中位數進行比較，根據結果判定待測疫苗的效力。

1.7 貓的免疫和抗體測定 隨機取10只貓，每只貓注射1個劑量的上述疫苗于后退肌肉，注射后密切觀察7 d后，如無異常，正常飼養，分別于接種前和接種后2、4、8周，180 d、360 d分別采集血清，通過FAVN方法測定抗體。對照貓不進行任何處理，并同上采集血清測定。

1.8 攻毒試驗 將免疫貓和對照貓分別置于鐵籠內隔離飼養，每只貓在咬肌注射BD06病毒2×105MIC LD50。觀察貓的臨床表現。攻毒貓在出現疑似狂犬病臨床表現時，采用安樂死的方式處理病貓，并采用上述熒光抗體對腦組織進行染色檢測確診。

2 結 果

2.1 疫苗效力 共制備病毒效價大于107.5/mL的細胞培養物4 000 mL，制備疫苗6 000 mL，分裝后制成疫苗5 385支。經測定，標準疫苗(稀釋至3.0 IU/mL)和待測疫苗免疫10只小鼠后血清樣品中中和抗體效力的中位數分別為7.86 IU/mL和9.36 IU/mL，因此，待測疫苗的效力>3.0 IU/mL。10只小鼠測定的結果如表1。

2.2 免疫貓不同時間中和抗體測定結果 通過FAVN方法測定的10只免疫貓在免疫后不同時間的中和抗體結果如表2。

表1 疫苗效力檢測結果

2.3 攻毒試驗結果 10只免疫貓攻毒后在觀察的90 d內無一出現異常臨床表現，試驗結束時未見任何貓死亡，全部獲得保護。對照的10只貓于攻毒后的11～32 d相繼死亡，經FAT檢測進一步確定為RABV感染。

3 討 論

本試驗采用的病毒株為本實驗室分離鑒定的JX04-45株，過去國內研制狂犬病疫苗大部分采用國外引進的疫苗株，如CVS-11、Flury-LEP、PV株等，有些則為國內人用疫苗弱毒株滅活苗，如CTN等。JX04-45株系分離自鼬獾的街毒，經過小鼠腦內連續傳代后潛伏期縮短為7 d，在BHK-21細胞上具有穩定和高滴度的復制能力。因此，本疫苗系首次采用國內分離的狂犬病病毒高效毒株制備的貓用狂犬病滅活疫苗。

由于采用特制的水包油佐劑，疫苗免疫效力在抗原含量不需特別高的情況下即可在動物體內誘導較高的抗體滴度，說明本佐劑可提高疫苗的效力。國內批準用于犬的狂犬病疫苗質量標準中標示的效力分別為2.0 IU/劑量和2.5IU/劑量，后者至今未見投放市場。進口的4種狂犬病疫苗效力均只在1-2IU/劑量范圍內。本疫苗可以達到3.0 IU/mL的效力，是目前國內動物用狂犬病疫苗效力中最高的。從抗體維持水平來看，犬用疫苗2.0 IU/劑量的效力在免疫后1年內后約有80%的犬保持在有效保護水平內，本疫苗免疫貓的抗體水平在1年后，100%(10/10)仍維持在保護水平以上。

表2 狂犬病新型佐劑疫苗在貓的免疫試驗

攻毒后，在陰性對照貓全部死亡的情況下，免疫貓全部健活。盡管犬用疫苗通常采用30條以上/組的犬進行保護性試驗，但保持30條貓的數量相對于其種類來說數量較大；由于貓對狂犬病病毒的敏感性較高，故10只貓的數量盡管屬于中等數量的樣本，但從未免疫對照組的全部死亡結果來看，攻毒數量和兩組之間的顯著差異可以看出，本研究制備的狂犬病滅活疫苗具有完全的保護效果。

本研究采用的佐劑為水包油佐劑，與其他已報道的狂犬病滅活疫苗采用的鋁佐劑有所不同。該佐劑制備簡單，采用普通疫苗使用的白油即可。佐劑性狀為乳黃色水樣，使用(注射)時極為方便，值得在同類滅活疫苗中推廣。

本研究效力的測定采用免疫動物的中和抗體技術，而非采用小鼠攻毒試驗，這種技術為半定量技術，需將標準疫苗稀釋為期望的最低值，待測疫苗只要到該疫苗最低值疫苗所誘導的抗體水平，就可說明待測疫苗優于標準疫苗所含的效力。但是由于該方法只能取試驗鼠血清測定結果的中位數或四分位數，而非全部鼠中和抗體的平均數，因此，也可能在一定條件下造成結果判定上的偏差。平均數在該類活體應答的檢測中也不宜應用，主要是因為個體對同一抗原的應答水平相差懸殊，不適合平均數的統計學分析，同時本方法使用小鼠20只，期限縮短至16 d，取代了使用220只動物，耗時28 d的NIH方法，大大節省了費用。

[1]Official website of World Health Organization[EB/OL]. 世界衛生組織官方網站 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/en/[EB/OL]

[2]The people’s Republic of China National Health and Family Planning Commission[EB/OL]. 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會 http://www.moh.gov.cn/3.htm[EB/OL]

[3]Song M, Tang Q. Analysis of related factors of rabies epidemic in China[J]. Chin J Epidemiol, 2005, 26(3): 956-959. (in Chinese) 宋淼，唐青.中國狂犬病流行相關因素分析[J].中華流行病學雜志, 2005, 26(3):956-959.

[4]Hu RL, Fooks AR, Zhang SF, et al. Inferior rabies vaccine quality and low immunization coverage in dogs (Canisfamiliaris) in China[J]. Epidemiol Infect, 2008, 137: 1-8.

[5]Cha L, Gao J, Hou JY. Safety and immune effect of adjuvant-free rabies vaccine[J]. Chin J Biologicals, 2006, 19(3): 206-207. (in Chinese) 查力，高軍，侯劍英.無佐劑狂犬病疫苗的反應及免疫效果觀察[J]. 中國生物制品學雜志， 2006，19(3)：206-207.

[6]Liu Y, Fang LJ, Zhao JH. Culture and immunogenicity of a rabies virus isolate from Ferret Badger[J]. Chin J Biologicals, 2011, 24(2): 192-194. (in Chinese) 劉曄，房麗君，趙敬慧.鼬獾狂犬病病毒分離株的培養及其免疫原性[J].中國生物制品學雜志，2011，24(2)：192-194.

[7]Zhang SF, Cao L, Zhang F. Establishment and application of hybridomas producing anti-rabies nucleoprotein McAb and fluorescent antibody virus neutralization test [J]. Chin J Lab Med, 2006, 29(6): 554-557. (in Chinese) 張守峰，曹亮，張菲.狂犬病毒核蛋白單抗和熒光抗體中和試驗的建立與應用[J].中華檢驗醫學雜志，2006, 29(6)：554-557.

Hu Rong-liang, Email: ronglianghu@hotmail.com

Effective inactivated rabies vaccine for feline use

ZHANG Fei,HE Na,WANG Ying,LIU Ye,ZHANG Shou-feng,HU Rong-liang

(InstituteofVeterinarySciences,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun130122,China)

In this study, we carried out immunity test in cats with a high effective rabies vaccine, which was developed with new oil-in-water adjuvant. By the fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) established in our laboratory, we assayed the efficacy of the vaccine in mice and monitored the neutralizing antibody level in cats after vaccination, and also challenged the cats to evaluate the immune effect of vaccine. Results showed that the efficacy of the vaccine tested in mice was to be more than 3.0 IU/dose and the vaccine had no adverse reaction in cats. The viral neutralizing antibody in cats was 16.04±4.29 IU/mL averagely 14 days post inoculation (dpi); 37.13±6.12 IU/mL, 28 dpi; 21.01±7.61 IU/mL, 56 dpi; 6.71±3.44 IU/mL, 180 dpi; 2.66±2.01IU/mL, 360 dpi. In 15 months, masseter muscle inoculation with 106MIC LD50of rabies virus BD06 strain was performed in cats. All cats in control group died after 90 days, while all in the vaccinated group survived, indicating the immune protection of the vaccine lasted for one year long.

rabies inactivated vaccine; cat; neutralizing antibody; challenge test

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.001

國家863課題(No.2012AA101303)資助

扈榮良，Email：ronglianghu@hotmail.com

軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，長春 130122

Supported by the National High Technology Research and Development Program (“863” program) of China (No. 2012AA101303)

R373

A

1002-2694(2015)08-0691-03

2014-07-18；

2014-11-21