吲哚類非甾體抗炎藥微生物限度檢查法的建立

蘭 毅

·實驗研究·

吲哚類非甾體抗炎藥微生物限度檢查法的建立

蘭 毅

目的 建立吲哚類非甾體抗炎藥微生物限度檢查法。方法 按歐洲藥典EP8th版, 對吲哚美辛膠囊微生物限度檢查方法學進行建立和驗證實驗。結果 吲哚美辛膠囊對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有很強的抑制作用, 本實驗方法消除了其抑菌性對微生物限度檢查的影響。結論 該方法適用于非甾體抗炎藥吲哚美辛膠囊的微生物限度檢查, 且可靠、便于操作。

非甾體抗炎藥；吲哚美辛；微生物限度檢查；驗證

非甾體抗炎藥（NSAIDS）主要是一大類具有抗炎、止痛和解熱作用的非類固醇藥物, 常用于治療慢性炎癥［1］。它可以減輕或控制由炎癥引起的如痛經、急慢性附件炎、盆腔炎所致的腰腹部疼痛、術后疼痛［2］、關節或軟組織的疼痛等癥狀。臨床上NSAIDS廣泛用于骨關節炎、類風濕關節炎和多種免疫功能紊亂炎癥性疾病及各種疼痛癥狀的緩解和腫瘤止痛的階梯治療［3］。這類藥物在檢查微生物限度時, 常發現有抑菌作用, 為保證檢驗結果的真實性、有效性, 需要消除其抑菌性。作者以吲哚類非甾體抗炎藥：吲哚美辛膠囊為例,按照歐洲藥典EP8th版微生物限度檢查法對其進行總需氧菌和霉菌酵母菌計數方法的建立和驗證, 以便為非甾體抗炎藥物微生物限度檢查方法提供科學依據。目前尚未見有關該產品微生物限度檢查方法的報道。

1 材料與方法

1.1 儀器 高壓滅菌鍋（FOB3-TS）, 生物安全柜（081297802 B）, 培養箱（FRIOCELL 111）, 電熱恒溫水槽（DKI-2）, 千分之一精密天平（PB303-S/FAC）。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌［ATCC6538］, 銅綠假單胞桿菌［ATCC9027］, 枯草芽孢桿菌［ATCC6633］, 白色念珠菌［ATCC10231］, 巴西曲霉［ATCC16404］均由Microbiologics提供, 具有ATCC官方授權。

1.3 培養基 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）, 沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）, 均由Becton, Dickinson and Company提供。所用試劑均為分析純。

1.4 樣品 吲哚美辛膠囊50 mg （批號：201402001、201402002、201402003）。

1.5 方法

1.5.1 菌液的制備 按歐洲藥典EP8th版方法進行菌液制備。菌液制備后若在室溫下放置, 應在2 h內使用；若保存在2～8℃, 可在24 h內使用［4］。

1.5.2 供試品的制備 取吲哚美辛膠囊10 g, 加pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml, 45℃水浴振搖使分散均勻［5］, 作為1：10的供試液, 備用。

1.5.3 稀釋液和沖洗液的制備 配制pH=7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液和pH=7.2磷酸鹽緩沖液, 121℃, 15 min高壓蒸汽滅菌。取pH=7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液作為稀釋液備用, pH=7.2磷酸鹽緩沖液作為沖洗液備用。

1.5.4 總需氧菌、霉菌及酵母菌計數方法學的建立

1.5.4.1 試驗組 ①傾注平皿法：取“1.5.2”供試液1 ml,分別加入0.1 ml菌懸液（≤100 cfu的菌懸液）, 立即注入45℃的溶化的瓊脂培養基15～20 ml, 搖勻, 凝固后, 將平板按菌落計數方法測定其菌落數, 作為試驗組。②培養基稀釋法：A：取“1.5.2”供試液1 ml, 分別加入到2個平皿（0.5 ml/平皿）中, 加入菌懸液0.1 ml/皿, 迅速倒入15～20 ml的瓊脂培養基,每個菌株平行制備2組平皿, 待凝；B：取“1.5.2”供試液1 ml分別加人5個平皿（0.2 ml/平皿）, 加入菌懸液0.1 ml/皿, 迅速倒入15～20 ml的瓊脂培養基, 每個菌株平行制備2組平皿,待凝。將平板按菌落計數方法測定其菌落數, 作為試驗組。③薄膜過濾法：取“1.5.2”供試液1 ml, 加入45℃的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液使其稀釋成200 ml［5］, 混勻, 作為供試液A。分別量取供試液A100 ml, 加入兩個無菌濾杯中,經0.45 μm親水混合纖維素酯濾膜過濾, 每張濾膜使用45℃的pH=7.2無菌磷酸鹽緩沖液分為三組進行試驗, 每組沖洗液使用量分別為300、400、500 ml沖洗濾膜, 100 ml/次, 真空抽濾, 在最后一次沖洗液中加人菌懸液0.1 ml, 濾干后取出濾膜, 菌面朝上貼于已制備好的相應瓊脂平板上, 將平板按菌落計數方法測定其菌落數, 作為試驗組。

1.5.4.2 菌液對照組 取試驗菌懸液0.1 ml, 按菌落計數方法測定其加入的試驗菌菌數。

1.5.4.3 供試品對照組 取“1.5.2”供試液1 ml, 按“1.5.4.1”,不加入任何試驗菌懸液, 分別測定不同試驗方法下供試品的本底菌數。

1.5.4.4 稀釋劑對照組 為考察供試液制備過程中微生物受影響的程度, 用pH=7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液替代樣品按供試液的制備方法制備成空白液, 加入上述5種備用菌液各0.1 ml, 分別測定其菌落數回收率。

1.5.5 回收率測定 各試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值、稀釋劑對照組的菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值均應在0.5～2.0范圍內。

2 結果

2.1 總需氧菌、霉菌及酵母菌計數方法選擇試驗結果 傾注平皿法測試總需氧菌計數時, 樣品對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌有明顯的抑菌作用, 其回收率均≤30%；但同時可以看出在測試霉菌及酵母菌計數時, 各菌種的回收率均在0.5～2.0之間且大約70%, 故對于霉菌酵母菌計數檢驗可采用傾注平皿法進行后續的方法學驗證, 不需再進行篩選。培養基稀釋法測試其總需氧菌計數時, 當樣品組為0.5 ml/plate, 樣品對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌仍存在明顯的抑菌作用, 其回收率均≤50%；當樣品組為0.2 ml/plate時, 雖然樣品對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑菌作用有明顯的改善, 但實驗操作繁瑣, 對于皿碟和標準菌株的需求數量要求過多, 僅需氧菌計數試驗一個樣品組和對照組就需要100個皿碟, 故試驗雖然可行但成本過高, 浪費試驗和計數時間以及培養箱的空間。薄膜過濾法測試其總需氧菌計數時, 當沖洗液使用量達到300 ml時, 均消除了樣品吲哚美辛對五種標準實驗菌株的抑菌作用。該實驗方法操作簡便, 同時也杜絕了培養基稀釋法試驗中對皿碟和標準菌株需求數量過多的弊端, 且節約試驗操作和計數的時間及培養箱的空間, 既可以消除其抑菌活性, 又能經濟高效的完成需氧菌的計數故對于吲哚美辛膠囊總需氧菌計數方法可采用薄膜過濾法進行后續的方法學驗證。見表1。

2.2 吲哚美辛膠囊微生物計數方法學適用性驗證 通過5種標準菌、3次獨立平行試驗的回收率方法學驗證, 吲哚美辛膠囊的微生物限度檢查方法為：總需氧菌計數采用“1.5.4.1”試驗組方法“③”薄膜過濾法, 沖洗液使用量為300 ml；霉菌酵母菌計數采用“1.5.4.1”試驗組方法“①”傾注平皿法進行微生物限度的計數檢查。見表2。

表1 總需氧菌、霉菌及酵母菌計數方法選擇試驗結果

表2 微生物計數方法學適用性驗證

3 討論

通過對本品的微生物限度檢查計數方法的驗證, 可采用薄膜過濾法和常規傾注平皿法結合分別對吲哚美辛膠囊總需氧菌, 霉菌菌酵母菌的微生物限度進行檢查。可見, 經過實驗篩選證明吲哚類非甾體抗炎藥物微生物限度檢查方法不能全部都采用常規方法（ 傾注平皿法） 進行檢查, 必須經過方法驗證, 根據驗證結果去選擇可靠的、準確的并且經濟、可操作性高的實驗方法, 才能滿足未來企業的需求。同時本產品微生物限度方法的建立還為其他具有抑菌成分的非甾體抗炎藥物以及近年來國內外研發出現的新劑型吲哚類藥物微生物限度檢驗方法的開發提供了技術理論上的參考。

［1］ 劉艷紅, 周小平, 劉榮華.非甾體抗炎藥研究進展.江西中醫藥, 2013（11）:78-80.

［2］ 穆兵.吲哚美辛在婦產科的臨床應用.新醫學, 2003, 34（3）: 188-192.

［3］ 朱春琴, 崔香玉, 鄭桂華.吲哚美辛的臨床新用途與不良反應.Herald of Medicine, 2002, 5（21）:112.

［4］ European Pharmacopoeia Commission, European Pharmacopoeia-8th Edition.185-189.

［5］ 孔令春.吲哚美辛的臨床應用進展.海峽藥學, 2006, 18（2）:116-118.

Establishment of microbial limit test for indoles non-steroidal anti-inflammatory drugs

LAN Yi.
School of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

Objective To establish the microbial limit test for indoles non-steroidal anti-inflammatory drugs.Methods According to European Pharmacopoeia 8th Edition, establishment and validation experiment were made for microbial limit test of indometacin capsules.Results Indometacin capsules contained strong inhibiting effect on staphylococcus aureus and bacillus subtilis.This experimental method eliminated the influence of its antibacterial activity on microbial limit test.Conclusion This method is appropriate for microbial limit test of non-steroidal anti-inflammatory drugs as indometacin capsules, and it is reliable and easily operational.

Non-steroidal anti-inflammatory drugs; Indometacin; Microbial limit test; Validation

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.10.190

2015-03-10］

300457 天津科技大學生物工程學院