海藻酸鈉固定細胞產D-阿洛酮糖的研究

李秋喜,林春芳,沐萬孟,江 波,張 濤

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

海藻酸鈉固定細胞產D-阿洛酮糖的研究

李秋喜,林春芳,沐萬孟,江 波*,張 濤

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

D-阿洛酮糖3-差向異構酶(DPEase)是一種能催化D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的異構酶。本實驗采用海藻酸鈉作為載體,包埋重組大腸桿菌催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。以固定化細胞的酶活活力回收率為指標,優化出最佳固定化條件為:海藻酸鈉濃度3%,細胞包埋量60g/L,CaCl2濃度2%,固定化時間4h,0.01%濃度戊二醛溶液中交聯4h。該條件下所得固定化細胞的酶活回收率高達76%,且具有較好的操作穩定性,重復操作8次后酶活回收率仍然保持61%。固定化后DPE細胞的最適酶反應溫度提高了5℃、最適pH與游離細胞基本一致,耐熱性明顯提高,pH穩定性與游離細胞一致。

D-阿洛酮糖,海藻酸鈉,固定化,D-阿洛酮糖3-差向異構酶

D-阿洛酮糖是近年發現的一種具有特殊保健功能的新型功能性因子,它的甜度相當于果糖的70%,能量只有蔗糖的0.3%,具有低能量、改善腸道菌群、降低血糖、抗齲齒等生理功能[1-4]。它是D-果糖在C-3位的差向異構體,目前能實現D-果糖到D-阿洛酮糖之間生物轉化的酶主要有兩種:D-阿洛酮糖3-差向異構酶(D-psicose 3-epimerase,縮寫為DPE)和D-塔格糖3-差向異構酶(D-tagatose 3-epimerase,縮寫為DTE),前者的最適底物為D-阿洛酮糖,后者則為D-塔格糖[5-7]。在稀有糖的生產上,日本香川大學Izumori團隊通過離子交換結合方法固定重組DTEase,酶結合效率達到90%[8-9]。韓國世宗大學Oh團隊選擇 Duolite A568離子交換樹脂對DPEase進行固定化,在硼酸鹽存在下,D-阿洛酮糖的轉化率達到65%[10]。國內江南大學江波團隊[11]采用大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D380為載體,以戊二醛為交聯劑,其酶活回收率達到20%以上。天津科技大學的研究團隊[12]用殼聚糖固DPE在填充床中反應得到D-阿洛酮糖的最高轉化率為24%。

細胞固定化技術是利用物理或化學手段將游離的微生物(細胞)或酶定位于限定的空間區域,并使其保持活性且能反復利用的一項技術[13]。包埋法是近年來發展迅速的一種新興細胞固定化技術,也是目前細胞固定化研究和應用最廣泛的方法[14-15]。本研究通過包埋-交流的方法對攜帶有DPE基因的大腸桿菌重組菌進行固定化的研究,探索了海藻酸鈉濃度、細胞包埋量、CaCl2濃度以及戊二醛交聯等對D-果糖轉化成D-阿洛酮糖的影響,初步獲得了一種固定化細胞生產D-阿洛酮糖的方法,具有工業化應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ClostridiumcellulolyticumDPEase(以下簡稱DPE) 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏菌種。酵母提取物、胰蛋白胨、氨芐青霉素(Amp)、Isopropyl β-D-1-thiogalactopyr-anoside(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,IPTG) 生工生物工程(上海)有限公司;海藻酸鈉、無水CaCl2、D-果糖、25%戊二醛溶液 中國醫藥集團化學試劑有限公司;D-阿洛酮糖標準品 Sigma公司。

Centrifuge 5804R 冷凍離心機 德國Eppendorf公司;SW-CJ-1FD 超凈工作臺 蘇凈集團安泰空氣技術有限公司;SHA-2冷凍恒溫水浴振蕩器 江蘇太倉實驗設備廠;Agilent 高效液相色譜系統 美國Agilent公司;RI-101 Shodex示差折光檢測器 日本Shodex公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組DPE細胞的發酵培養 將ClostridiumcellulolyticumDPEase菌種接種于4mL LB液體培養基(含50μg/mL 氨芐抗生素)中,37℃條件下200r/min培養過夜;將其接種至200mL LB液體培養基中,37℃,200r/min培養至OD600值為0.6～0.8,加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG,28℃條件下200r/min誘導培養6h,高速冷凍離心收集菌體,即得重組DPE細胞。

1.2.2 重組DPE細胞的固定化 稱取一定量的海藻酸鈉加水10mL,加熱攪拌充分溶解,待冷卻后將5mL的菌懸液加入海藻酸鈉溶液中混合攪拌30min。用帶有針頭的注射器將上述混合液以60滴/min的速度滴入CaCl2溶液中,即形成大小均一的光滑小球,0～4℃條件下靜置硬化一定時間。抽濾,用Tris-HCl緩沖溶液(50mmol/L、pH8.0 Tris-HCl,下同)洗滌三次,抽濾干燥,濾紙吸干表面水分,即得固定化細胞小球,0～4℃懸浮于Tris-HCl緩沖液中保存[16]。

1.2.3 固定化條件優化 采用單因素對比實驗進行海藻酸鈉濃度、細胞濃度、CaCl2濃度、固定化時間等條件的優化實驗。海藻酸鈉濃度為3%,細胞包埋量60g/L,CaCl2濃度為2%,固定化時間4h,控制3因素不變,變化1個因素,海藻酸鈉濃度1%～3%,細胞包埋量20～70g/L,CaCl2濃度2%～10%,固定化時間1～10h,來確定各因素對固定化效果的影響。包埋法同1.2.2,硬化完成后待其溫度與戊二醛溫度相當時,加入一定濃度的戊二醛溶液,并于4℃靜置交聯。交聯完成后,用Tris-HCl緩沖溶液洗滌三次,抽濾干燥,濾紙吸干表面水分,即得固定化細胞小球,0～4℃懸浮于Tris-HCl緩沖液中保存。并在最優包埋條件下進行戊二醛濃度,交聯時間的優化。戊二醛濃度0.01%～0.09%,交聯時間0.5～5h。

1.2.4 固定化細胞的酶學性質

1.2.4.1 固定化細胞的最適溫度與溫度穩定性 在最優條件下固定化細胞,并按1.3分別測定固定化細胞和游離細胞在不同溫度條件下(45、55、60、65、70和80℃)反應時的酶活。分別取0.5g固定化細胞小球和0.1g游離細胞加1mL Tris-HCl緩沖液在45、50、55、60、65、70和80℃溫度條件下靜置1h后,按照1.3分別測定酶活。

1.2.4.2 固定化細胞的最適pH和pH穩定性 在最優條件下固定化細胞,然后取0.5g固定化細胞小球于4mL離心管中,在不同pH緩沖液環境下55℃反應5min后按1.3測固定化細胞酶活。同時測游離細胞在不同pH緩沖液反應酶活。分別取0.5g固定化細胞小球于4mL離心管中,加1mL不同pH緩沖液4℃放置1h后用去離子水潤洗三遍按1.3測固定化細胞酶活。同時測游離細胞在不同pH緩沖液中4℃靜置1h后酶活。

1.2.5 固定化細胞的操作穩定性 在最優條件下固定化細胞,取0.5g固定化細胞小球于4mL離心管中,固定化細胞的酶活測定方法同1.3,反應完成后用去離子水潤洗固定化細胞三次后重復上述操作,連續進行8次實驗,分別計算酶活回收率。并探究不同戊二醛濃度下交聯的固定化小球的操作穩定性。

1.3 檢測方法

游離DPE酶活測定:反應體系為100g/L底物D-果糖(用50mmol/L pH= 8.0 Tris-HCl緩沖液配制)和適量菌體,55℃水浴恒溫反應5min,沸水浴停止反應。

固定化DPE酶活測定:稱取固定化小球0.5g,加1mL 100g/LD-果糖,55℃反應5min,取500μL上清沸水浴10min。

酶活力定義為:每分鐘產生1μmolD-阿洛酮糖為一個酶活力單位。

酶活回收率:固定化細胞的酶活回收率是指固定化細胞的總活力與用于固定化的總酶活力的百分率。

酶活回收率(%)=固定化酶總活力/用于固定化的總酶活力×100

糖組分測定方法:HPLC(高效液相色譜)法,Agilent 1200Series高效液相色譜,Sugarpak-1鈣型陽離子交換柱,Shodex RI-101示差折光檢測器;流動相:純水,柱溫:85℃,流速:0.4mL/min,進樣量:10μL。

2 結果與討論

2.1 固定化條件的優化

2.1.1 海藻酸鈉濃度對固定化的影響 海藻酸鈉的濃度會影響固定化細胞的機械強度、質量傳遞等,進而影響到細胞的酶活。由圖1可知,隨著海藻酸鈉濃度的增加,固定化細胞的酶活回收率不斷增加,這是因為當載體濃度太低時形成的凝膠結構孔徑較大,結構不穩定,且顆粒的機械強度不好,細胞容易流失;但海藻酸鈉濃度太高,又會導致溶液粘度過高,溶解困難,與細胞懸浮液無法均勻混合,推壓注射器費力且形成的固定化顆粒拖尾,形狀不規則。綜合考慮以上各因素,固定化細胞時,海藻酸鈉濃度以3%為宜,該條件下形成的固定化小球有相對較高的酶活回收率,且成型均勻,凝膠強度良好。

圖1 海藻酸鈉濃度對固定化效果的影響Fig.1 Effect of concentration of sodium alginate on immobilization of DPEase activity

2.1.2 細胞包埋量對固定化的影響 固定化載體中細胞與膠體的比例可能影響酶活回收率。如圖2,酶活回收率隨細胞包埋量的增加呈先增加后減小的趨勢,這主要是當細胞濃度大于60g/L時,載體上的細胞分子密度增大,位阻效應加劇,導致部分細胞失活。故較佳的細胞終濃度取60g/L。

圖2 細胞包埋量固定化效果的影響Fig.2 Effect of cell concentration on immobilization of DPEase activity

2.1.3 CaCl2濃度對固定化的影響 不同濃度的CaCl2溶液會影響固定化顆粒的硬化效果。如圖3,CaCl2溶液濃度增大時,一方面形成的空間網狀結構過于緊密,對酶的空間結構造成了影響;另一方面,可能是由于鹽的高滲透壓作用,引起細胞脫水,致使細胞活性部分喪失,酶活回收率呈下降趨勢。所以CaCl2濃度選擇2%。

圖3 CaCl2溶液濃度對固定化效果的影響Fig.3 Effect of calcium ion concentration on immobilization of DPEase activity

2.1.4 固定化時間對固定化的影響 海藻酸鈉包埋細胞是一個平衡的過程。如圖4,在4h左右時,酶活回收率最大,隨著時間的延長,酶活沒有增加反而降低,說明細胞在載體上包埋已經達到平衡,時間再長,酶的結構反而會受到影響,酶活回收率隨之下降。因此,選擇固定化時間為4h。

圖4 固定化時間對固定化效果的影響Fig.4 Effect of solidifying time on immobilization of DPEase activity

2.1.5 戊二醛濃度對固定化的影響 單獨用包埋法所得的固定化細胞容易泄漏。戊二醛是一種常用的雙功能試劑,其結構中的兩個醛基可分別與載體及酶分子中的氨基反應,使載體和載體之間及酶和載體之間交聯,增強凝膠結構的強度和穩定性。如圖5,戊二醛濃度低于0.05%時,酶活回收率變化不大;濃度增大酶活回收率反而下降。原因可能是戊二醛使酶蛋白變性,細胞酶活性被破壞。所以戊二醛的最佳濃度范圍為0%～0.05%。

圖5 戊二醛濃度對固定化效果的影響Fig.5 Effect of flutaraldehyde concentration on immobilization of DPEase activity

2.1.6 戊二醛交聯時間對固定化的影響 戊二醛交聯時間也會影響固定化細胞酶活回收率。如圖6,戊二醛交聯4h時固定化細胞活最高;低于4h,戊二醛和酶蛋白的交聯不完全,水洗后會使一部分細胞脫落;高于4h,由于戊二醛上可發生交聯反應的醛基數目有限,所以再增加交聯時間固定化細胞酶活回收率基本不變。

圖6 戊二醛交聯時間對固定化效果的影響Fig.6 Effect of flutaraldehyde crosslinking time on immobilization of DPEase activityv

2.2 固定化細胞的酶學性質及穩定性

2.2.1 固定化細胞的最適反應溫度 取適量游離細胞和固定化細胞,分別在45～80℃溫度下反應,測定酶活。如圖7,游離細胞的最適溫度為65℃,固定化細胞的最適溫度提高到了70℃。

圖7 固定化細胞與游離細胞的最適反應溫度Fig.7 Relative activity of free and immobilized cells under different temperature conditions

2.2.2 固定化細胞的溫度穩定性 各取適量固定化細胞和游離細胞,分別在45～80℃保溫1h,測其殘余酶活力,如圖8,細胞被固定化后耐熱性有所提高,原因可能是凝膠結構對細胞起到了保護的作用[17]。

圖8 固定化細胞和游離細胞的熱穩定性Fig.8 Effect of temperature on the activity of immobilized cells and free cells

2.2.3 固定化細胞的最適反應pH 在pH分別為6.0～7.5磷酸緩沖液和8.0,9.0的巴比妥鈉-鹽酸緩沖液存在下測定固定化細胞和游離細胞的酶活。如圖9所示,細胞被固定化后最適反應pH范圍沒有變化。

圖9 固定化細胞與游離細胞最適反應pHFig.9 Relative activity of free and immobilized cells under different pH value conditions

2.2.4 固定化細胞的pH穩定性 在不同pH的緩沖液下處理1h的游離細胞和固定化細胞殘余活力如圖10,固定化細胞的pH穩定性有所增強,細胞經過包埋和交聯后被固定在凝膠結構中,使外界因素對細胞的酶作用影響減弱。

圖10 固定化細胞與游離細胞的pH穩定性Fig.10 Effect of pH value on the activity of immobilized cells and free cells

2.2.5 固定化細胞的操作穩定性 固定化細胞較游離細胞有較好的操作穩定性。如圖11所示,未經過戊二醛交聯和經過戊二醛交聯的固定化細胞酶活回收率呈現先增加后下降的趨勢,第5次的酶活回收率較第1次提高了一倍,實驗操作過程中凝膠小球的體積明顯增大。原因可能是,潤洗和酶反應是個冷熱交替處理凝膠顆粒的過程,凝膠顆粒出現明顯溶脹,小球表面積增大使細胞內的DPE酶與底物接觸性變好,有利于酶反應。但是溶脹后孔徑變大,反復操作,細胞容易流失,所以酶活回收率從第5次開始下降。另外,低濃度戊二醛(低于0.05%)對操作穩定性影響不大,濃度過高反而使同批次操作穩定性變差。所以綜合考慮酶活回收率以及操作穩定性,戊二醛濃度選擇0.01%。

圖11 固定化細胞的操作穩定性Fig.11 Operation stability of immobilized cells

3 結論

以海藻酸鈉為載體,戊二醛為交聯劑,對DPE重組細胞進行固定化,研究得出固定化細胞的最優條件為:海藻酸鈉濃度3%,細胞包埋量60g/L,CaCl2濃度2%,固定化時間4h,0.01%戊二醛,交聯時間4h。該條件下所得酶活回收率高達76%,且具有較好的操作穩定性,重復操作8次后酶活回收率仍然保持61%。固定化后DPE細胞的最適溫度提高了5℃、最適pH與游離細胞基本一致,耐熱性明顯提高,pH穩定性與游離細胞一致。海藻酸鈉包埋法成本低,操作簡單,條件較為溫和,操作穩定性好,適合用于工業化生產D-阿洛酮糖。但還需要進一步的研究,比如固定化細胞反應器,提高轉化率等方面的內容。

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Research of the immobilization of microbial cells in sodium alginate forD-Psicose conversion

LI Qiu-xi,LIN Chun-fang,MU Wan-meng,JIANG Bo*,ZHANG Tao

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

D-Psicose 3-epimerase(DPEase)is an enzyme that catalyzes the reversible isomerization betweenD-fructose andD-psicose. In this study,the calcium alginate gels was used as carrier to immobilize the microbial cells with DPEase. The enzymatic properties of the immobilized and free DPEase were studied to get the optimal parameters. The results showed that the optimum operation conditions were:3.0% sodium alginate,60g/L of embedded cell,2% CaCl2,solidifying time 4h,0.01% flutaraldehyde,crosslinking time 4h.Under the optimum condition,the recovery rate reached 76% .After eight times repeated operations,the recovery rate reached more than 61%,showing good operational stability. Compared with the free microbial cells with DPEase,the optimum temperature of immobilized DPEase raises 5 degrees,the pH value wasn’t changed. Besides,the pH and thermal stabilities of immobilized DPEase were better than the free microbial cells.

D-Psicose;sodium alginate;immobilization;D-Psicose 3-epimerase

2014-06-16

李秋喜(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食品酶技術。

*通訊作者:江波(1962-)，男，博士，教授，研究方向：食品酶技術。

科技部十二五863計劃(2013AA102102)；紹興市科技計劃項目(2013A23002)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0172-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.028