牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細胞增殖和遷移的影響

劉 賓,李媛媛,王曉明,曹鳳波,霍貴成,楊麗杰

(東北農業大學,乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細胞增殖和遷移的影響

劉 賓,李媛媛,王曉明,曹鳳波,霍貴成,楊麗杰*

(東北農業大學,乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

本文探討牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細胞生長和遷移的作用,為治療人類胃腸炎癥提供一種安全可靠的方法。給予CaCO-2細胞一定劑量的牛初乳生長因子粗提物,通過MTT法,分別測定12、24、36h細胞的增殖率;用BCA試劑測定CaCO-2總蛋白質含量;用劃線法測定細胞的遷移能力。結果表明:與對照組相比,細胞增殖率與牛初乳生長因子粗體物有劑量依懶性。培養12h時,100ng/mL牛初乳生長因子即能顯著刺激細胞增殖,達到16.3%(p<0.05),1μg/mL時,有最大的增殖率20.6%;培養24,36h時,1μg/mL牛初乳生長因子粗提物對細胞有最大增殖率,分別達到30.8%和40.0%,但是此時顯著低于10%胎牛血清對細胞的增殖率;細胞蛋白質和遷移速度也與牛初乳生長因子粗提物濃度呈現劑量依懶性關系,在10μg/mL時,達到最大含量和遷移速度;本研究證實牛初乳生長因子粗提物能顯著促進細胞增殖,蛋白質含量增加和細胞遷移速度。

初乳,生長因子,增殖,遷移

牛初乳是指奶牛分娩后7d內特別是3d內所分泌的乳汁。初乳中不僅含有豐富的營養物質以及免疫球蛋白,還含有大量的生長因子,特別是泌乳后2d內[1]。隨著泌乳時間延長,3～4d后初乳中的生長因子水平已經趨近于常乳。

牛初乳是自然界中唯一含有兩類主要生長因子(類胰島素生長因子(IGF-Ⅰ,Ⅱ)和轉化生長因子(TGF-β1,β2))的天然產物[2],而且IGF-Ⅰ和TGF-β2也是初乳中含量最高的兩種生長因子,EGF只在分泌初期含量較多[3]。初乳還含有其他生長因子,如血小板生長因子(PDGF)、上皮生長因子(EGF)、成纖維生長因子(FGF)等。它們主要刺激表皮、上皮和胚胎細胞的增殖,抑制胃酸分泌,促進傷口愈合和骨吸收,在胚胎發生、組織修復、骨和結締組織形成以及免疫控制中起重要作用[4]。IGF-Ⅰ與胃腸粘膜細胞酪氨酸激酶受體結合,使腸黏膜細胞生長和增殖,腸絨毛高度增加,促進小腸發育[5]。另外,研究發現IGF-I除能促進腸細胞生長外,還能刺激腸道組織中IgA的mRNA表達水平的提高,以維持腸道黏膜液層的功能[6]。表皮生長因子能夠刺激表皮、上皮和胚胎細胞增殖,且無種屬特異性,還能促進細胞內DNA、RNA、蛋白質、鳥苷酸脫氧核糖的合成以及細胞外大分子的合成。在小腸和結腸修復時,EGF能減少隱窩分裂,增加其增殖[7]。有研究證實從乳清中去除β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和乳鐵蛋白,剩余成分比胎牛血清有更強的促細胞生長作用,對許多細胞系有增殖作用,這表明除常規營養成分外,促細胞生長作用歸于其中的生長因子。但是Belford U[8-9]等研究發現TGF-β2能夠抑制上皮細胞的分裂,由于其在初乳和初乳乳清中還有很高濃度的IGF-Ⅰ,Ⅱ及其結合蛋白,而且牛初乳中還含有其他促進細胞增殖的生長因子EGF,PDGF,FGF-2及含有結合蛋白[10-12],提取的促有絲分裂提取物仍有很強促細胞增殖的效果。

現代生活節奏的加快,飲食不規律,胃腸病發生率越來越高,日常生活中人們幾乎都會不同程度地發生急性或慢性胃腸病。數據顯示我國有近30%的人患有各種胃炎,目前全國胃病患者的總人數粗略估計就有近4億人,而且其中40%病情嚴重。乳源生長因子預防和治療這些疾患顯現出巨大的潛能,不僅來源廣泛,而且安全有效。而且應用乳源生長因子代替胎牛血清,用于細胞工程也具有很大的潛力。單一生長因子對傷口愈合,胃腸炎治療,細胞增殖都已經被驗證。Simat Siti Fatimah[13]等證實表皮生長因子(EGF)能調節人羊膜上皮細胞循環周期,顯著增加S-和G2/M細胞比例,促進細胞增殖,Igor Sukhotnik[14]等證實轉化生長因子-α(TGF-α)能夠修復和改善由氨甲喋呤引起的大鼠腸損傷,顯著增加空腸和回腸腸、黏膜的重量,DNA、蛋白質的含量以及絨毛的長度,呂劍光[15]等研究牛初乳胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)對氨甲喋呤引起大鼠腸損傷的影響,證實IGF-Ⅰ能夠明顯修復大鼠腸道損傷,降低因腸道損傷而大量產生的二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的含量。幾種生長因子協同對上皮細胞增殖和遷移的作用仍然是未知的。本實驗主要是以CaCO-2為模型,研究從牛初乳中提取的生長因子提取物對CaCO-2細胞增殖和遷移方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳 由黑龍江完達山松北牧場提供;凝乳酶 由丹尼斯特(中國)有限公司提供;胰蛋白酶 購自北京索萊寶科技有限公司;高糖DMEM培養液 購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司;CaCO-2 由東北農業大學乳品重點實驗室提供;胎牛血清(FBS) 購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司;噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、細胞裂解液 購自青島海泰生物技術有限公司。

JC10-NN3MT-100乳成分分析儀 北京北信科儀分析儀器有限公司;低速離心機LD4-2 北京醫用離心機;300ku陶瓷膜超濾儀 北京華創源泉環境技術有限公司;100、30ku超濾離心管 上海艾研生物科技有限公司;HF90型CO2培養箱 香港力康發展有限公司;潔凈工作臺VD-1320 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;AE-30型倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司;6孔板、96孔板 北京欣源佳和生物科技有限公司;Model 680型酶標儀 美國Beckman公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛乳基本成分的測定 將分娩后2d內的牛初乳和常乳置于水浴鍋中恒溫至25℃,上機測定奶樣成分。

1.2.2 牛初乳中生長因子粗提物的提取 將健康母牛分娩后2d內的牛初乳,過濾除雜,離心脫脂(7000r/min,15min,4℃),小心地取出上層脂肪,將脫脂乳控溫至37℃,邊攪拌邊緩慢加入凝乳酶(效價1萬,添加量0.1%),37℃保溫凝乳,凝乳后將乳塊破碎,在8000r/min,4℃下離心20min,收集乳清[16]。用陶瓷膜超濾儀除去乳清中大于300ku的大分子物質,然后將濾出的清液分別依次用100、30ku的超濾離心管離心(4000×g,15min,4℃),收集最后的清液。

將所得的提取液進行脫鹽處理,采用3500u的透析袋,吸水劑為聚乙烯吡咯,將所得產物冷凍干燥后貯存,即為生長因子粗提物。

1.2.3 MTT法測定初乳生長因子對CaCO-2促增殖作用 將處于對數生長期的CaCO-2細胞,用胰蛋白酶消化,含10%胎牛血清的DMEM培養基配制成單細胞懸液調整細胞密度約為1×105/mL,以每孔100μL加入96孔培養板。將牛初乳生長因子提取物配制成1mg/mL,作為母液,用無血清的DMEM配制成100、10、1μg/mL、100、10、1ng/mL梯度濃度的實驗溶液。培養24h后,吸取培養液,加入不同濃度的實驗溶液100μL,空白對照組加無血清培養基,含10% FBS的培養基為陽性對照組。細胞在37℃,5%二氧化碳狀態下分別培養24、36和48h后,每孔加入3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT)20μL。繼續37℃孵育4h后,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100μL,震蕩10min。于酶聯免疫檢測儀490nm波長檢測OD值,并計算增殖率。初乳生長因子對CaCO-2細胞的促生長作用以CaCO-2細胞增殖率來衡量,計算公式:

細胞增殖率(%)=(A實驗組-A對照組)/A對照組×100

1.2.4 牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2蛋白質含量的影響 用含10% FBS的高糖DMEM培養液將密度為5×104個/mL細胞接種于6孔板中,待細胞匯合程度達到60%時,換用無血清的DMEM培養基繼續培養24h,使其同步化。棄去原培養液,添加100、10、1μg/mL、100、10ng/mL的生長因子粗提取物,空白用無血清DMEM細胞組做對照。在細胞培養箱中繼續培養24h。用4℃的PBS沖洗3遍,每瓶加入0.5mL含0.1%的Trition細胞裂解液,置于-20℃和4℃條件下,反復凍融30min。將各組蛋白溶液轉移到96孔板中,每組20μL,加入BCA(bicinchonininc acid)法蛋白測定液100μL,震蕩10min,測定570nm條件下的OD值。

1.2.5 牛初乳生長因子對CaCO-2遷移的影響 用含10%胎牛血清的DMEM培養液將CaCO-2細胞接種到24孔板中,每孔1mL,待細胞鋪滿底層板時,換用無血清的培養基培養24h,使其同步化,用嚴格滅菌的槍頭在底部劃出一條直線,并做好標記,用PBS清洗3次,分別加入100、10、1μg/mL、100、10、1ng/mL生長因子粗提物。分別記錄0、12、24、36h的圖像,用Image plus+軟件計算遷移距離,遷移距離=劃痕0h后劃痕寬度-劃痕處理后劃痕寬度。

1.2.6 數據處理 數據以Means±SD表示,統計學分析采用SPSS19.0進行單因素方差分析。以p<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 牛初乳中的基本成分

牛初乳中與常乳中的營養成分有明顯的區別(見表1),初乳中的脂肪和蛋白質含量明顯高于常乳,灰分含量略微高于常乳。

表1 牛初乳基本成分的測定

2.2 牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細胞生長的影響

在培養12h時,和對照組相比(見表2),牛初乳生長因子粗提物在1ng/mL～1μg/mL的濃度范圍內,CaCO-2細胞的增殖呈現劑量依賴性,并且在1μg/mL時,對細胞具有最大的促生長作用,與含10%胎牛血清高糖DMEM具有相似的增殖率。當濃度再次增大時,增殖率反而略有下降。

在培養24h時,與對照組相比(見表3),牛初乳生長因子在1ng/mL～1μg/mL的濃度范圍內,仍然與CaCO-2細胞具有劑量依賴性關系,在1μg/mL時,具有最大增殖率,要比對照組高出30%,但是要顯著低于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基對細胞促生長作用。隨著濃度增大,細胞增殖速率反而會略有降低。

表2 牛初乳生長因子與CaCO-2細胞的劑量效應(12h)

注:數據表示為平均值±標準差(n=3)。同一列數據中字母相同則表示差異不顯著(p>0.05),不同則表示差異顯著(p<0.05),表3、表4同。

表3 牛初乳生長因子與CaCO-2細胞的劑量效應(24h)

與對照組相比(見表4),用含牛初乳生長因子粗提物的培養基培養CaCO-2細胞,36h后,牛初乳生長因子在1ng/mL～1μg/mL作用范圍內,呈現劑量依賴性(p<0.05),1ng/mL的牛初乳生長因子粗提物能顯著促進CaCO-2細胞生長。在1μg/mL時,具有最大促生長作用,但是增殖率要顯著低于含10%FBS的高糖DMEM對細胞的促生長作用。

表4 牛初乳生長因子與CaCO-2細胞的劑量效應(36h)

2.3 牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2總蛋白含量的影響

細胞同步化培養后,經含不同濃度牛初乳生長因子粗提物的DMEM培養基培養CaCO-2細胞,發現不同濃度牛初乳生長因子粗提物都能顯著促進CaCO-2細胞總蛋白質含量的增加(見圖1),且隨著濃度的增加,細胞總蛋白質含量呈現劑量依賴性,且10ng/mL牛初乳生長因子粗提物能顯著增加細胞蛋白含量(p<0.05)。10μg/mL牛初乳生長因子粗提物較大幅度提高細胞蛋白質濃度,但是低于用含10%FBS的高糖DMEM對細胞總蛋白的作用。

圖1 不同濃度生長因子粗提取對CaCO-2總蛋白質含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of growth factors extract on CaCO-2 total protein content注:與對照組相比,*p<0.05;**p<0.01。

2.4 牛初乳生長因子對CaCO-2細胞遷移的影響

與對照組細胞相比(見圖2、圖3),不同濃度牛初乳生長因子都能顯著促進細胞遷移(p<0.05)。濃度增大,遷移速度明顯加快,在10μg/mL條件下,有最大的遷移速度。在濃度大于10ng/mL時,單位時間內,遷移的速度顯著快于對照組。在×40倍光鏡下觀察,發現含有10μg/mL牛初乳生長因子粗提物組細胞的遷移速度要明顯快于100ng/mL組,更顯著快于對照組(p<0.01)。

圖2 不同濃度牛初乳生長因子對CaCO-2細胞遷移的影響Fig.2 Effect of different concentrations of colostrum growth factor on CaCO-2 cells migration

圖3 不同濃度生長因子粗提物對細胞遷移的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of colostrum growth factor on CaCO-2 cells migration

2.5 討論

目前,國內關于牛初乳生長因子粗體物對上皮細胞增殖和遷移的研究并不多,BELFORD[8]等用陽離子交換色譜層析技術從乳清中提取富含促有絲分裂的成分,其中里面就含有大量的生長因子活性成分,作用于多種成纖細胞和上皮細胞。其研究發現乳中促有絲分裂物能促進中胚層細胞增殖,但是能抑制上皮細胞生長。但是本研究卻發現牛初乳生長因子粗體物能促進上皮細胞CaCO-2生長。在24h時,其促細胞增殖率和含10%胎牛血清培養基促細胞增殖率是基本上相同的。然而,繼續培養細胞36,48h時,牛初乳生長因子粗提物仍能促進上皮細胞CaCO-2的生長,但是其對細胞的增殖率已經顯著低于含10%胎牛血清培養基對細胞增殖率。可以看出牛初乳生長因子粗提物能夠在短時間內促進上皮細胞CaCO-2生長。Timothy E. Rayner[17]等認為盡管牛初乳促有絲分裂提取物中含有抑制上皮細胞系生長的TGF-β2,但是仍然含有很高濃度的IGF-Ⅰ,Ⅱ及其結合蛋白,EGF,PDGF,FGF-1,2,促進上皮細胞的生長。

胰島素樣生長因子-Ⅰ受體具有潛在有絲分裂原作用,正常水平下其與胰島素樣生長因子-Ⅰ結合后可致β亞單位的磷酸化激活酪氨酸激酶活性細胞信號傳導路徑,起到促進細胞有絲分裂增殖和轉化的作用[18]。表皮生長因子及其受體啟動的最重要的信號轉導途徑是Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK,與細胞的增殖轉化和分化相關[19]。CaCO-2細胞在含1μg/mL牛初乳生長因子粗提物時具有最大生長速率,而隨著濃度增大,增殖率反而有所降低,可能是由于作用于細胞上的生長因子受體已經趨于飽和或者是部分作用。因為轉化生長因子能夠抑制上皮細胞增殖,多種其他生長因子促進細胞增殖,使得各種生長因子相互協調,達到相對平衡所致。

李彩虹[20]等研究發現表皮生長因子能夠促進人羊膜間充質干細胞的遷移,并證明了遷移與EGFR-PI3K信號通路有關。Timothy E. Rayner[10]等證實促有絲分裂乳清生長因子能加速大鼠傷口愈合速度。這與本文的研究結果是相符的。細胞遷移速度與生長因子粗提物濃度具有劑量依懶性,且作用時間越長,遷移效果越明顯。

雖然與單一生長因子的納克級相比,乳源生長因子粗提物作用范圍在微克級,但是乳源生長因子作為一種治愈腸道黏膜損傷以及替代血清應用細胞工程具有極大的潛力。

3 結論

牛初乳中含有大量生長因子,作為一種來源廣泛,安全的原料,提取里面的生長因子治療腸胃炎癥疾病具有很大前景。本研究通過將提取的牛初乳生長因子粗提物作用于上皮細胞CaCO-2。發現牛初乳生長因子粗提取能顯著促進CaCO-2細胞的增殖和增加細胞總蛋白質含量,能夠短期替代胎牛血清,而且能顯著加快細胞遷移速度,對于治療胃腸粘膜疾病具有積極作用。

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Effect of colostrum growth factors extracts on proliferation and migration of CaCO-2 cells

LIU Bin,LI Yuan-yuan,WANG Xiao-ming,CAO Feng-bo,HUO Gui-cheng,YANG Li-jie*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China)

In this study,the effect of colostrum growth factors extracts on the proliferation and migration of CaCO-2 cells was investigated,which provided a safe and reliable way for the treatment of human gastrointestinal inflammation. Proliferation rate of CaCO-2 cells were determined by MTT assay at 12,24,36h respectively,CaCO-2 total protein content were determinated by BCA reagent. The migration of CaCO-2 cells were determined by scratch assay after given a dose of colostrum growth factors extracts. Results indicated that CaCO-2 cells were related with colostrum growth factors extracts in a way of dose-dependent manner,compared with the control group. Colostrum growth factors with 100ng/mL could stimulated dramatically the proliferation of CaCO-2 cells at culturing 12h,by 16.3%(p<0.05). When the concentration was 1μg/mL,the cells had the maximum proliferation rate by 20.6%. Colostrum growth factors extracts with 1μg/mL could stimulate cells with maximum proliferation at culturing 24,36h,increased by 30.8% and 40.0%,respectively,but significantly lower than the proliferation rate by the medium containing 10% fetal bovine serum. Cells protein content and migration speed also had related with colostrum growth factors extracts in a way of dose-dependent manner. There were the maximum protein content and migration speed with 10μg/mL. These results demonstrated that colostrum growth factors extracts significantly accelerated cells proliferation rate,increased cell protein content and migration speed.

colostrum;growth factors;proliferation;migration

2014-06-25

劉賓(1989-),男,碩士,研究方向：乳品科學。

*通訊作者:楊麗杰(1956-),女,碩士，教授,研究方向：乳品安全與監控。

黑龍江省教育廳面上項目基金資助。

TS252.1

A

1002-0306(2015)07-0354-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.066