紫外結合亞硝酸誘變選育中性蛋白酶高產菌株

唐雪鷺,崔 春,雷芬芬,舒 會,趙謀明,*

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640;2.廣東省食品綠色加工與營養調控工程技術研究中心,廣東廣州 511400)

紫外結合亞硝酸誘變選育中性蛋白酶高產菌株

唐雪鷺1,2,崔 春1,2,雷芬芬1,2,舒 會1,2,趙謀明1,2,*

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640;2.廣東省食品綠色加工與營養調控工程技術研究中心,廣東廣州 511400)

為提高一株深海來源微小桿菌屬細菌Exiguobacteriumsp. SWJS2 產中性蛋白酶的酶活,本文先后采用紫外線和亞硝酸對其進行誘變處理。紫外誘變條件為8W紫外燈在20cm處直接照射50s;三輪誘變后得突變株UV-48,其酶活較原始菌株提升21.32%。再以UV-48為出發菌株進行亞硝酸誘變,條件為0.03mol/L亞硝酸作用8min;三輪誘變后得突變株HN-34,其酶活為1109U/mL,較突變株UV-48提升13.97%,較原始菌株提升38.28%。HN-34傳代5次相對酶活均在94%以上,遺傳性狀穩定。

中性蛋白酶,誘變,紫外,亞硝酸,微小桿菌屬

中性蛋白酶是一類作用于蛋白質肽鍵的水解酶,其在中性pH(6.0～7.5)條件下活力最高,并在食品加工領域應用廣泛,如飲料澄清[1]、風味改善[2]、動植物蛋白酶解[3]及其副產物的高值利用[4]等。此外,中性蛋白酶在皮革處理和飼料生產方面也有重要應用。

常見的微生物蛋白酶以細菌[5](芽孢桿菌屬和假單胞菌屬)來源為主,也有來自放線菌(鏈霉菌屬[6])和真菌[7](曲霉、根霉和毛霉屬)等,但以細菌蛋白酶的酶反應速率和穩定性較好[8]。本實驗室從中國南海深海海泥中篩選得到一株微小桿菌屬細菌,其產蛋白酶的基本酶學特性[9]如下:最適pH為7,并在pH5～9范圍內穩定;最適作用溫度40～45℃,活性受EDTA抑制明顯;40℃下保溫1h全部失活;屬中性中溫金屬蛋白酶,但熱穩定性靠近低溫蛋白酶。在優化后的培養條件[7]下該細菌所產中性蛋白酶的酶活可達802U/mL,相較其他產堿性蛋白酶且酶活不高的微小桿菌屬細菌[10-11],該菌株優勢明顯。

紫外照射能在同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體,亞硝酸則可脫去堿基中的氨基。不同種類、劑量誘變劑的搭配使用效果不同[12],以上兩者的結合使用就已成功用于提高α-環糊精葡萄糖基轉移酶[13]、乳酸鏈球菌素[14]和ε-聚賴氨酸[15]等代謝物的產量。本文先后采用紫外線、亞硝酸進行誘變處理,以期進一步提高該深海菌株產中性蛋白酶的酶活,為其與陸生菌種所產蛋白酶在酶解方向的對比研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Exiguobacteriumsp. SWJS2 篩選自中國南海深海海泥,由本實驗室保藏。

酪氨酸 購于sigma公司;酪蛋白(干酪素) 購于上海潤捷化學試劑有限公司;高級海水素 購于廣州海寶生物科技有限公司。其余化學試劑均為分析純。

試管斜面保藏培養基(g/L) 牛肉浸膏4,蛋白胨6,酵母浸出粉2,氯化鈉5,瓊脂5,pH7.2±0.1;液體種子培養基(g/L) 蛋白胨5,酵母浸出粉1,海水素33.3,pH7.2±0.1;發酵培養基(g/L) 甘油3,葡萄糖5,酵母浸出粉10,氯化鈉10,磷酸氫二鉀0.5,硫酸鎂0.3,硫酸銨1,氯化鈣1，pH7.2±0.1;篩選培養基(酪蛋白-瓊脂平板)(g/L) 酪蛋白10,牛肉浸膏3,氯化鈉5,磷酸氫二鉀2,瓊脂15,pH7.2±0.1。上述所有培養基的滅菌條件均為121℃,20min。

3-18k臺式離心機 德國sigma儀器公司;SW-CJ-1F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;HZQ-X300C恒溫振蕩培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;XMTD-204電熱恒溫水浴鍋 北京市醫療設備廠;UV-2100紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的建立

1.2.1.1 制備菌懸液 將保藏菌種Exiguobacteriumsp. SWJS2轉接至酪蛋白平板,3次劃線分離得純培養物。取一環接入液體種子培養基,180r/min、37℃搖床培養12h即得。

1.2.1.2 測定生長曲線 以2%接種量將上述菌懸液接種于10mL液體種子培養基中(100mL錐形瓶),振蕩混勻后以相同條件繼續培養。每隔2h取出一瓶,立即放于4℃冰箱中保存[16]。24h結束后,以未經接種的液體種子培養基為空白調零,于600nm波長下測定各瓶菌液的吸光度值OD600。以培養時間為橫坐標,OD600為縱坐標,繪制菌株生長曲線。

1.2.2 最適稀釋倍數的確定 以無菌生理鹽水對未經誘變劑處理的菌懸液進行十倍稀釋,以能使平板上的初始菌落總數在100～300之間者為最適稀釋倍數。誘變所需菌懸液采用相同稀釋倍數。

1.2.3 紫外(UV)誘變 取稀釋后的菌懸液100μL涂布酪蛋白平板。在黑暗條件下使涂布完成的平板于8W紫外燈正下方20cm處直接照射不同時間。照射前應預熱20min穩定紫外燈;照射達設定時間后關燈,每組設3個平行。所有平板37℃恒溫避光培養36h后取出計數,以未經照射的平板為對照,計算致死率。以紫外照射時間為橫坐標,致死率為縱坐標,繪制致死率曲線。

1.2.4 亞硝酸(HNO2)誘變

1.2.4.1 確定最適作用濃度 向盛有2mL菌懸液的滅菌錐形瓶中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L亞硝酸鈉溶液各1.0mL,立即加入7mL(0.5mol/L)pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(反應所得HNO2的終濃度為0.01～0.05mol/L)?；旌弦河?7℃水浴保溫振蕩5min,各取500μL加入9.5mL(0.07mol/L)pH8.5磷酸氫二鈉溶液中,終止反應。以不經水浴保溫而立即振蕩均勻并稀釋至適宜倍數的菌懸液為空白對照,不同處理濃度各設一個對照。處理后的菌懸液稀釋至適宜倍數,各取100μL涂布酪蛋白平板,每組設3個平行。所有平板37℃恒溫培養36h后取出計數,計算致死率。由遺傳育種經驗,選擇存活菌變異顯著且正變率較高的80%左右致死率[17],并以該致死率對應的亞硝酸鈉溶液濃度為最適作用濃度。

1.2.4.2 確定最佳作用時間 選用最適作用濃度的亞硝酸鈉溶液,以1.2.4.1方法處理菌懸液,但將水浴保溫時間調整為1、2、3、4、5、6、7、8、9min,空白對照設置方法相同。以亞硝酸作用時間為橫坐標,致死率為縱坐標,繪制致死率曲線。

1.2.5 突變菌株的篩選

1.2.5.1 平板初篩 從致死率為80%～90%的酪蛋白平板上挑取菌落,劃線培養獲得單菌落后點種于酪蛋白平板,每組設3個平行。37℃恒溫培養36h后均勻滴入10%三氯乙酸(TCA)。選擇透明圈直徑與菌落直徑的比值(H/C值)較大的單菌落再次純化。

1.2.5.2 搖瓶復篩 初篩所得單菌落經富集培養,取500μL種子液接種至25mL發酵培養基(250mL錐形瓶),180 r/min、25℃搖床培養44h[9]。8000×g離心10min取上清液即得粗酶液。3次測定求平均值,選擇酶活最高的菌株再次誘變。

1.2.6 蛋白酶活力的測定 在特定條件下每分鐘催化1μmol底物轉化為產物所需的酶量定義為1個單位(U)[18],本實驗以福林法[19]測定粗酶液的酶活力。蛋白酶活力(U/mL)=ΔOD680×K×(4/10)×n。其中,ΔOD680為待測樣品與空白對照的吸光度差值;K為吸光系數,即OD值為1.0時對應的1mL酪氨酸的質量,μg;本實驗中K=97.7614;n為粗酶液的稀釋倍數。

1.2.7 遺傳穩定性實驗 將篩選所得突變菌株連續傳代5次,分別測其搖瓶發酵所得粗酶液的中性蛋白酶活力。

2 結果與討論

2.1 菌株生長曲線

由圖1可知,菌株在接入種子培養基后延滯期較短,從第2h起進入對數生長期并持續約8h。10～22h菌體數量穩定,第24h表現出衰退特征。處于對數生長中后期的菌懸液,其菌體對理化因素較為敏感且大小均勻;較大的菌液濃度則能在一定程度上減少致死率誤差。綜合以上兩點選用種齡為12h的種子液進行誘變處理。

圖1 菌株Exiguobacterium sp. SWJS2的生長曲線Fig.1 Growth curve of Exiguobacterium sp. SWJS2

2.2 紫外誘變結果

由圖2可知,紫外照射60s時菌體已接近完全死亡。前60s內菌體死亡率與照射時間呈正相關,50s時致死率可達80%。從該組平板分離單菌落進行初篩和復篩,并將粗酶液酶活最高的菌株再次誘變。3輪誘變后所得結果見表1,可知酶活高低與H/C值的正相關性較弱;可能是由于菌株在固、液培養基中的產酶能力不同[20]。突變株UV-48搖瓶發酵所得粗酶液的酶活為973U/mL,較原始菌株酶活802U/mL提高21.32%。將UV-48作為出發菌株進行亞硝酸誘變。

圖2 致死率隨紫外照射時間的變化Fig.2 Death curve of ultraviolet mutation

菌株號H(cm)C(cm)H/C蛋白酶活(U/mL)酶活提升程度(%)原始菌株2.800.654.3802-UV-482.200.504.497321.32UV-412.500.406.395519.08UV-632.800.515.595018.45UV-582.550.604.393416.46UV-552.700.604.592815.71UV-452.400.415.991313.84UV-142.800.456.290412.72UV-532.500.604.590212.47

注：*H為水解圈直徑,C為菌落直徑,H/C為二者比值。

2.3 亞硝酸誘變結果

由圖3,UV-48經0.03mol/L HNO2作用5min后致死率接近80%,故以0.03mol/L為亞硝酸誘變的最適濃度(對應亞硝酸鈉溶液的濃度為0.3mol/L)。以最適濃度作用不同時間所得的致死率曲線如圖4,亞硝酸作用8min后致死率達80%以上。從該組平板分離單菌落進行初篩和復篩,并將粗酶液酶活最高的菌株再次誘變。3輪誘變后所得結果見表2。突變菌株HN-34的酶活較該菌株UV-48提高13.97%,較原始菌株提高38.28%。

圖3 致死率隨亞硝酸作用濃度的變化Fig.3 Relationship between lethality and the concentration of HNO2

圖4 致死率隨亞硝酸作用時間的變化Fig.4 Relationship between lethality and the action time of HNO2

菌株號H(cm)C(cm)H/C蛋白酶活(U/mL)酶活提升程度(%)UV-482.200.504.4973-HN-342.700.604.5110913.97HN-402.550.653.9110513.57HN-442.500.604.210669.56

注：*H為水解圈直徑,C為菌落直徑,H/C為二者比值。

2.4 遺傳穩定性實驗

將HN-34連續傳代5次,測定各代菌株搖瓶發酵所得粗酶液的中性蛋白酶酶活。由表3可知,蛋白酶活并不嚴格隨傳代次數的增加而減少,而是表現出一定的波動性,但各代菌株所產蛋白酶的相對酶活比較接近并均在94%以上。整體而言突變菌株HN-34酶活穩定,結果的波動性可能源于除培養基組成、溫度、時間和轉速以外其他因素對發酵產酶的影響。

3 結論

深海菌株Exiguobacteriumsp. SWJS2的對數生長期開始于第2h并持續約8h,穩定期時長12h,與陸生細菌同中存異,二者酶解效果的差異值得進一步研究。紫外誘變將該細菌所產中性蛋白酶的酶活提升21.32%,亞硝酸誘變再提升13.97%,最終較原始菌株提升38.28%;但提升程度不及已報道的其他菌種的代謝產物(50%以上至數倍)。分析原因可能有以下五點:其一,微小桿菌屬為革蘭氏陽性菌,厚密的細胞壁使其對于紫外線和亞硝酸作用的耐受能力較革蘭氏陰性菌更強;其二,合成機制不同的代謝產物對于誘變劑的作用效果存在差異;其三,原始菌株所產蛋白酶的酶活遠高于其他已報道的微小桿菌屬細菌,其本身的酶活提升程度有限;其四,兩種誘變劑的分開使用對于細菌基因的改造程度不及二者的復合作用;其五,3輪誘變尚不足以獲得可觀的提升程度。因而,換用其他種類誘變劑和其相互之間的搭配使用方式并適當增加誘變輪數,將有可能獲得更高的酶活提升程度。除與陸生菌種蛋白酶酶解效果的對比研究外,后續還可關注該細菌蛋白酶與同屬其他種細菌蛋白酶酶學特性的異同。

表3 突變株HN-34的遺傳穩定性實驗結果

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Study on the screening high yield neutral-protease-producing strain by combing UV and nitrous acid mutagenesis

TANG Xue-lu1,2,CUI Chun1,2,LEI Fen-fen1,2,SHU Hui1,2,ZHAO Mou-ming1,2,*

(1.School of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Guangdong Food Green Processing and Nutrition Regulation Technologies Research Center,Guangzhou 510640,China)

UV and HNO2were successively used to promote the enzyme-activity of the neutral protease produced by a marine bacteriaExiguobacteriumsp. SWJS2. Being directly exposed to 8W UV for 50s with a vertical dimension of 20cm,mutant strain UV-48 with a promotion of 21.32% were obtained after three turns of mutagenesis and then be applied into HNO2mutagenesis for further promotion. Being diluted by 0.03mol/L HNO2for 8min,UV-48 was finally turned into HN-34 with a promotion of 13.97% than itself and 38.28% than the starting strain after three turns. After pass-generation tests for five times,the mutant strain HN-34 was proved to be genetically stable since the five relative enzyme-activity were all above 94%.

neutral protease;mutagenesis;UV;nitrous acid;Exiguobacteriumsp.

2014-07-14

唐雪鷺(1991-),女,碩士研究生,研究方向:食品生物技術。

*通訊作者:趙謀明(1964-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術,蛋白質深加工技術。

深海微生物活性物質挖掘與其利用技術(2012AA092104);廣東省海洋經濟創新發展區域示范專項(GD2012-D01-002);熱帶海洋微生物新型耐鹽特異性蛋白酶的挖掘與應用(2013418018-7)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0163-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.026