雞蛋清中功能蛋白及活性肽的研究進展

于志鵬,趙文竹,*,劉靜波

(1.渤海大學化學化工與食品安全學院,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養與功能食品研究室,吉林長春 130062)

雞蛋清中功能蛋白及活性肽的研究進展

于志鵬1,趙文竹1,*,劉靜波2,*

(1.渤海大學化學化工與食品安全學院,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養與功能食品研究室,吉林長春 130062)

蛋清中功能蛋白及活性肽具有多種生理活性,對人類健康及疾病的預防和治療方面的巨大潛力,成為食品領域的研究熱點之一。本文綜述了蛋清蛋白中的主要功能蛋白的結構及功能,生物活性肽研究進展,并對蛋清蛋白及活性肽的研究進行展望,以期為后續深入的基礎研究和應用開發提供參考。

雞蛋,蛋白,活性肽,結構

雞蛋由蛋殼,蛋清和蛋黃三部分組成,分別占雞蛋質量的9%～11%,60%～63%和28%～29%。雞蛋主要成分為脂類,蛋白質和水分,分別占總質量的11%～12%,12%～16%和73%～76%,同時還含有少量的維生素和礦物質。蛋清是一種由蛋白質和水組成的膠體物質,其中85%～89%為水分,9.7%～10.6%為蛋白質,0.4%～0.9%為碳水化合物,0.5%～0.6%為礦質元素,0.03%為脂類和少量維生素等[1-2]。蛋清中的蛋白質主要包括54%的卵清蛋白,12%的卵轉鐵蛋白,11%的卵類粘蛋白,3.4%的溶菌酶,4.0%的G2球蛋白,4.0%的G3球蛋白,3.5%的卵粘蛋白,0.8%的卵黃素蛋白,1.0%的卵糖蛋白,0.5%的卵巨球蛋白,0.05%半胱氨酸蛋白酶抑制劑,1.5%的卵抑制劑以及0.05%的抗生素蛋白[3-4]。

1 雞蛋清中的功能蛋白

1.1 卵清蛋白

卵清蛋白(Ovalbumin)是蛋清的主要蛋白質,因糖和磷酸基與肽鏈相連而歸類于磷脂糖蛋白,單鏈糖側鏈與Asn的酰胺鍵以共價鍵形式連接,分子量為45000u,其等電點為pH 4.5。Mcreynolds 等通過mRNA 測序分析卵清蛋白由385個氨基酸組成,Nisbet等通過蛋白質測序也進一步證實該結論。蛋清中除存在卵清蛋白外,還含有卵清蛋白基因相關蛋白X和卵清蛋白基因相關蛋白Y,氨基酸序列見圖1,三種蛋白均存在糖基化(N-乙酰葡萄糖胺),二硫鍵(-S-S-)和巰基(-SH)[5]。卵清蛋白中二分之一氨基酸殘基為疏水性,三分之一的氨基酸殘基帶電荷,并含有6個半胱氨酸殘基(Cys11,Cys30,Cys73,Cys120,Cys367,Cys382),其中Cys73和Cys120形成二硫鍵(-S-S-),而4個巰基中3個在自然狀態下反應較弱,第四個巰基僅在蛋白變性狀態下反應強烈[6]。卵清蛋白具有兩個磷酸化作用點,分別位于Ser 68 和Ser 344,卵清蛋白存在3種形式,即含有兩個磷酸基團的卵清蛋白A1,一個磷酸基團的卵清蛋白A2和零個磷酸基團的卵清蛋白A3,并且3種分子存在形式的比例為81-84∶14-16∶2-4,研究證實可通過離子交換色譜,聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳將卵清蛋白存在的3種結構有效分離[7]。Stein等通過高場核磁測定自然狀態下的卵清蛋白二級結構中α螺旋含量為30%,β折疊含量為32%;通過圓二色譜測定α螺旋含量為30%,β折疊含量為40%,通過拉曼光譜測定卵清蛋白二級結構中α螺旋含量為25%,β折疊含量為25%,這些結果的差異主要來源于測定條件,尤其是pH和離子強度。

圖1 蛋清中卵清蛋白的一級結構Fig.1 Primary amino acid sequences of ovalbumin and related protein注:卵清蛋白(P01012 OVAL_CHICK),卵清蛋白X(P01013 OVALY_CHICK),卵清蛋白Y(P01013 OVALX_CHICK)，來源NCBI數據庫，圖2同。

1965年,Smith 等首次報道卵清蛋白在存儲過程中會轉變為更具有熱穩定性的S-卵清蛋白,變性溫度由卵清蛋白對應的84.5 ℃轉變為92.5℃,兩種形式(卵清蛋白和s-卵清蛋白)共存條件下變性溫度變為88.5 ℃[8]。研究表明,新鮮雞蛋中s-卵清蛋白占整個卵清蛋白5%或更少的比例,而雞蛋經6個月低溫儲存后,卵清蛋白中轉化為s-卵清蛋白的比例高達81%,s-卵清蛋白的出現伴隨著蛋清蛋白質流動性增強及出現稀釋狀,并且不利于蛋品的制作和加工,被認為是雞蛋營養價值的降低及功能活性的損失。s-卵清蛋白在55℃和pH10的磷酸鹽(100mmol/L)環境中很容易形成,而且溫度和pH 越高越有利于加速其轉化速率。目前更多的研究表明卵清蛋白具有潛在的免疫活性,同時也是蛋清的主要過敏源[8]。

1.2 卵轉鐵蛋白

目前,卵轉鐵蛋白的純化方法主要利用液相色譜純化包括陽離子交換色譜,陰離子交換色譜等,該方法能夠避免蛋白變性進而保留更高的生物活性。研究表明三次連續離子交換色譜純化卵轉鐵蛋白得率達到89%。卵轉鐵蛋白與血清中轉鐵蛋白具有相似的結構性質,主要是這些蛋白源于相同的基因,僅是相連接的碳水化合物有差別而已。X射線晶體分析表明卵轉鐵蛋白多肽鏈折疊為兩個lobe(N端lobe和C段lobe)進而分為四個結構域,每個lobe由兩個大小相似的結構域構成,即N端lobe由N1和N2結構域組成,C段lobe由C1和C2結構域組成,每個結構域約有160個氨基酸殘基組成[11]。這兩個lobe 通過非平行beta紐帶連接,beta紐帶可以允許其空間結構展開與閉合,而每個鐵結合位點均深藏于lobe內部。通過序列比對,這兩個lobe 具有相似的結構,大多數的二級結構元素相一致,主要區別在于彎曲區域的序列的插入與敲除。Apo-與holo-卵轉鐵蛋白的晶體結構如圖2,表明通過Fe3+的結合或釋放將會影響卵轉鐵蛋白空間結構大的變化。

圖2 卵清蛋白晶體結構Fig.2 Crystal structure of ovalbumin注:A為卵清蛋白的apo形態,B為卵清蛋白的holo形態。

通過考察卵轉鐵蛋白對不同革蘭氏陽性菌和陰性菌生長影響實驗,表明卵轉鐵蛋白具有體外抑菌活性,該活性主要依賴于卵轉鐵蛋白對Fe3+較強的結合力,而Fe3+是細菌生長的必要元素。卵轉鐵蛋白具有抑菌活性并不僅僅是因為能夠從中間產物中移除Fe3+,整個過程是一個極為復雜的體系,包括通過陽離子結構域OTAP-92與細菌膜結合方式等。OTAP-92由92個氨基酸殘基構成,位于卵轉鐵蛋白N端lobe的N2結構域的109～200殘基位置,其具有六個半胱氨酸殘基構成的3個二硫鍵橋形成了雙螺旋結構,這些結構為抑菌活性起到重要作用。事實上,卵轉鐵蛋白或是結合金屬已飽和的卵轉鐵蛋白(如Zn2+卵轉鐵蛋白)具有抑菌活性是由于其直接與細菌表面發生作用[12]。研究表明卵轉鐵蛋白的apo和 holo兩種形式均具有抑菌活性,而且卵轉鐵蛋白還具有抑制真菌活性和抗病毒活性。卵轉鐵蛋白的抗菌性與目前廣為認可的乳鐵蛋白相似,并且在蛋清中的含量也遠高于乳鐵蛋白在乳制品中的含量,因此卵轉鐵蛋白可作為工業化的營養強化劑添加到食品或保健品中。

1.3 卵粘蛋白

卵粘蛋白(Ovomucin)是一種硫酸化蛋清糖蛋白,占蛋清蛋白質量的2%～4%,而且在濃厚蛋清分布含量比在稀薄蛋清中高2～4倍,除存在于蛋清中還存在于卵系和卵黃膜外層中。蛋清的凝膠性主要歸因于卵粘蛋白,在雞蛋保存過程中最明顯的變化即蛋清的稀釋主要是因為卵粘蛋白的降解[13]。卵粘蛋白至少由兩個亞單元構成,即α-卵粘蛋白和β-卵粘蛋白,這些亞單元含有不同的氨基酸組分及多糖含量。α-卵粘蛋白的多肽鏈由2807個氨基酸殘基組成,通過SDS-PAGE電泳分析其分子量為180000至220000u,Watanabe等計算其分子量約為254000u,該結果略高于之前利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定結果。研究發現濃厚蛋清中α-卵粘蛋白組分經凝膠過濾色譜純化后再經交聯葡聚糖凝膠色譜分析得到兩條帶,即為α1-卵粘蛋白和α2-卵粘蛋白,分子量分別為150000u和220000u。β-卵粘蛋白亞基單元依次經聚丙烯酰胺凝膠電泳和超高速離心方法測得其分子量分布在400000～720000u,研究表明β-卵粘蛋白的片段由827個氨基酸序列組成且分子量為91836u,而β-卵粘蛋白的全序列分析有待進一步研究[14]。蛋清中包含兩種形式的卵粘蛋白,分別為可溶性卵粘蛋白和不溶性卵粘蛋白。可溶性卵粘蛋白主要分布于蛋清中的濃厚蛋白和稀薄蛋白,而不溶性蛋白僅分布在濃厚蛋清中,而且可溶性蛋白和不溶性蛋白組分中的α-卵粘蛋白和β-卵粘蛋白亞基單元的組成比例是不同的。不溶性卵粘蛋白由67%的α-卵粘蛋白和33% 的β-卵粘蛋白組成,可溶性卵粘蛋白由87%的α-卵粘蛋白和13% 的β-卵粘蛋白組成。α-卵粘蛋白和β-卵粘蛋白中多糖組分分別占15%和60%,由于不同卵粘蛋白亞基單元中多糖含量的差異以及卵粘蛋白中所含亞基單元比例的差異,卵粘蛋白的復合體中的多糖含量存在不同程度的差異,并且卵粘蛋白中的碳水化合物多以線性側鏈的3-6寡糖為主[15]。卵粘蛋白及其活性肽除了具有維持蛋清結構及粘度等物理功能,還對雞新城疫病毒、牛輪狀病毒和人流感病毒具有體外抑制活性,因此卵粘蛋白可作為抗病毒活性產品進行開發。

1.4 溶菌酶

溶菌酶(Lysozyme)廣泛存在于人類及動物體內的分泌腺、體液和組織中。溶菌酶又稱為胞壁質酶或N-胞壁質聚糖水解酶,作為水解酶主要裂解細胞壁多糖的糖苷鍵形成糖肽,水解位點是N-乙酰胞壁酸的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺的4位碳原子間的β-1.4糖苷鍵[16]。雞蛋清中含有極高的溶菌酶,約占整個雞蛋清的3.5%,含量為2500～3500μg/mL,鴨蛋清中溶菌酶含量為1000～1300μg/mL,鵝蛋清中溶菌酶含量為500～700μg/mL。禽蛋清中溶菌酶含量均高于牛乳中含量,因此市場上出現的溶菌酶主要從蛋清中提取純化獲得的產品,然而溶菌酶在禽類體內的作用尚未闡明。溶菌酶是一種堿性蛋白質,含有129個氨基酸殘基,分子量為14300u,其等電點位于10～11范圍,同時是第一個獲得全序列信息及三維結構的蛋白質[17]。溶菌酶由兩個結構域(N端結構域和C端結構域)組成,這兩個結構域由α-螺旋長鏈連接,并且在α-螺旋長鏈區域內存在酶的活性位點。溶菌酶N 端結構域為44～88 氨基酸殘基位置,該結構域內含有一部分α-螺旋和絕大部分的β-折疊結構,而C端結構域為1～39氨基酸殘基和89～129氨基酸殘基兩部分組成,該結構域的二級結構主要為α-螺旋結構。溶菌酶分子形成內部疏水性和外部親水性的構型,表面分布大量的極性基團而疏水性集團內嵌于酶分子內部[18]。溶菌酶分子構象遷移主要來自于兩個結構域相互運動,通過兩個結構域的空間位置的相對轉變進而實現底物能夠自由進入并與活性位點結合發揮催化作用[17,19]。

溶菌酶具有高等電點特性,因此可以與卵粘蛋白、卵轉鐵蛋白、卵清蛋白和糖蛋白中帶負電荷的唾液酸鍵合。這些能夠與溶菌酶鍵合的組分均含有多糖物質。溶菌酶自身具有較高的穩定性,肽鏈中的四個二硫鍵使得這個小蛋白分子結構非常穩定,其中兩個二硫鍵用于維持酶活性,另外兩個二硫鍵則與酶的熱穩定性息息相關,在高溫100 ℃條件下活性仍能維持1～2min。溶菌酶在酸性溶液中(pH3.0～4.0)也有相似的高穩定性,然而溶菌酶對硫醇極為敏感,很容易發生鈍化。因此在60℃條件下,雞蛋中的溶菌酶因與此條件下卵清蛋白中的游離巰基發生反應導致其活性喪失[20]。溶菌酶單體具有顯著的抑菌活性,尤其對革蘭氏陽性菌的抑制尤為顯著,并已被應用于食品及藥品當中,同時有文獻證明溶菌酶可作為免疫調節和免疫激活劑[3]。

1.5 黃素蛋白

黃素蛋白(Flavoprotein)又稱核黃素結合蛋白,該蛋白在蛋清和蛋黃中均有分布,約占蛋清蛋白質量的0.8%。蛋清中黃素蛋白是由219個氨基酸殘基組成的多肽單鏈,并且N端氨基酸殘基為焦谷氨酸,焦谷氨酸作為N端氨基酸殘基現象極為少見,其中30%氨基酸構成6個α-螺旋結構(A～F),約有近15%氨基酸殘基形成4個β-折疊結構(a～d)。4個α-螺旋結構(A～D)與4個β-折疊結構(a～d)形成與核黃素結合的位點,而另外兩個α-螺旋結構(E～F)則圍繞在蛋白的磷酸化位點的區域,該區域為186-197氨基酸殘基。黃素蛋白主要包括兩個結構域,即N端結構域和 C端結構域,N端結構域分子量較大位于1-170 氨基酸殘基區域,核黃素結合位點也分布在該區域。C端結構域相對分子量較小,該區域位于171-219氨基酸殘基且存在大量負電荷氨基酸,包含8個磷酸絲氨酸殘基和10個谷氨酰胺殘基。磷酸絲氨酸殘基構建了黃素蛋白的緊密的結構:Ser185-Glu-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu-Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Met-Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu200。黃素蛋白共含有18個半胱氨酸殘基形成的9個二硫鍵橋使得蛋白質構型和活性更加穩定,其中8個二硫鍵橋位于磷酸化活性位點區域,第9個二硫鍵橋則用于連接黃素蛋白的兩個結構域。

黃素蛋白中多糖含量約為14%,主要為海藻糖,甘露糖,半乳糖,乙酰葡萄糖胺和唾液酸。盡管兩個N-糖苷位點(Asn-36和 Asn-147)都存在于保守的五肽中,保守五肽中的四個氨基酸已經確定,然而所含多糖分子不同而存在差異,連接到Asn-36(CHO-36)多糖分子所含的支鏈度明顯低于連接到Asn-147(CHO-147)支鏈度,而且蛋清中黃素蛋白和蛋黃中核黃素蛋白所相連的多糖分子是完全不同的,這與蛋白合成在不同的組織存在一定的關系。核黃素能夠以1∶1比例與apo-黃素蛋白緊密結合,解離常數為1.3×10-9,而且核黃素一旦與蛋白結合后結構極其穩定。蛋清中黃素蛋白與核黃素的結合飽和率為35-50%,而蛋黃中黃素蛋白與核黃素的結合飽和率幾乎為100%。

1.6 抗生物素蛋白

抗生物素蛋白(Antibiotic protein)約占蛋清蛋白組分的0.05%,含量達到50mg/L,是一種堿性且高穩定性蛋白質,pH7～9條件下變性溫度為85℃,等電點約為10.5,最多連接4個生物素分子,與生物素結合后變得更加穩定,變性溫度升高到132℃。抗生物素蛋白與生物素結合后化學穩定性明顯增強,在尿素濃度為9mol/L或7mol/L的鹽酸條件下仍保持原有活性。抗生物素蛋白具有4個亞單位,每個亞單位由128個氨基酸殘基組成,每個亞單位的理論分子量為14340u,因此抗生物素蛋白的理論分子量為57400u,而實際測定分子量為67000u,主要是未考慮抗生物素蛋白的糖基化。抗生物素蛋白四聚體晶體結構為分子對稱構型,蛋清中的抗生素蛋白的糖基化位點位于第17個氨基酸殘基的Asn。通過傅立葉紅外光譜和拉曼紅外光譜分析抗生物素蛋白的apo-和holo-構型的三維結構表明蛋白與生物素結合后對蛋白的三維結構幾乎沒有影響。

2 雞蛋清中的活性肽

自上個世紀50年代初,隨著分離和檢測技術的迅速發展,活性肽這一研究領域進入了嶄新的快速發展時期。活性肽因其兼具化學合成和化學修飾等特點吸引越來越多的農業工程、生物工程、化學工程及其交叉領域研究人員的研究興趣。國內外研究學者研究發現禽蛋蛋白質酶解產物具有降血壓,抗氧化,抗菌,促進礦物質吸收和免疫調節作用。蛋清活性肽研究最早始于1995年,Fujita[21]等人證明卵清蛋白的酶解產物具有抑制血管緊張素轉化酶的活性,從此開啟了人們對雞蛋蛋白活性肽的關注。You[22]等人對蛋清中溶菌酶蛋白及其酶解產物進行了實驗,發現溶菌酶酶解產物具有抗氧化等多種生物活性,并初步對酶解產物進行離子交換色譜純化獲得7個組分,對各個組分的活性進行測定,利用質譜測定組分2和組分6中所含活性肽的序列為KRHGLDNY,RHGLDNYRGY,KRHGLDNYRGY,KKIVSDGNGM,HGLDNY,YGIL,AKKIVSD GNGM,ATNRNTDGSTDYGILQ,AKKIVSDGNGM。Miguel[23]等人利用胃蛋白酶裂解3h后進行活性測定,發現酶解產物具有抗氧化活性,同時檢測到該酶解產物還具有血管緊張素轉化酶抑制活性。Wu[24]等人利用蛋白質組學技術分析不同來源雞蛋蛋白的差異性,并對蛋清肽的生物酶解制備,純化和結構鑒定開展了研究[25-27],并對構效關系進行了系統的研究[28-29],重點研究了二肽和三肽的一級結構與體外活性的關系。Chi[30]等人對卵清蛋白的功能性進行了修飾,并優化了生物酶解制備卵清蛋白活性肽的條件及色譜分離方法[31],表明酶解產物具有一定的生理活性[32]。Yu[33-36]等人利用色譜結合蛋白質組學技術對蛋清蛋白酶解產物進行高效分離和結構鑒定共獲得19個活性肽序列,并證明活性肽具有抗糖尿病和降血壓等功效,同時為禽蛋資源活性肽的快速篩選提供了一個參考。

3 展望

蛋清蛋白及活性肽的功能受到越來越多地關注,2011～2013年蛋加工領域獲得的國家自然科學基金資助的項目總計9項,主要側重:蛋清蛋白凝膠特性、致敏性及相應機理研究;蛋白/肽構效關系機制研究;傳統蛋制品加工中的基礎研究;蛋清肽的結構與吸收關系研究。更多的研究開始側重于對雞蛋蛋白及活性肽。鑒于雞蛋蛋白及活性肽對人體營養及生理調節的重要作用,建立雞蛋各種功能蛋白提取純化的工業化路線將有利于推廣其在日常飲食中應用,一者拓寬了禽蛋產業的加工鏈,提高了產品的附加值,改變目前產品相對單一和低值化現狀;再者也有效解決了人體所需的功能活性組分的原料來源且該原料相對容易獲得。雞蛋功能蛋白及活性肽的研究目前還停留在基礎研究階段,基礎研究成果順利工業化轉化將成為未來研究的熱點和難點。

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Progress in the functional proteins and bioactive peptides of hen egg white

YU Zhi-peng1,ZHAO Wen-zhu1,*,LIU Jing-bo2,*

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Jinzhou 121013,China;2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China)

Proteins and bioactive peptides in egg white exert diverse biological activities,and are potential sources for human health and disease prevention and treatment,and become one of research content in the field of food. The current work reviewed the structure and function of proteins,research progress in bioactive peptide,and discussed its further research development,aimed to provide the references for the related research.

hen egg;protein;bioactive peptide;structure

2014-07-14

于志鵬(1984-),男,博士,講師,研究方向：蛋白質及活性肽的功能研究與產品開發。

*通訊作者:趙文竹(1986-),女,博士,講師,研究方向:蛋白質及活性肽的功能研究與產品開發。 劉靜波(1962-)女,博士,教授,研究方向:營養與功能食品。

國家自然科學基金面上項目(31271907);國家科技支撐課題(2012BAD00B03)。

TS201

A

1002-0306(2015)07-0387-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.073