山蒼子揮發油超聲波輔助提取工藝優化及其GC-MS分析

李文爽,江曉波,王 濤,姜媛媛,張 利,李 梅,魏 曉

(1.四川農業大學 生命科學學院,四川雅安 625014;2.四川農業大學 理學院,四川雅安 625014;3.四川農業大學 林學院,四川雅安 625014)

山蒼子揮發油超聲波輔助提取工藝優化及其GC-MS分析

李文爽1,江曉波1,王 濤1,姜媛媛1,張 利2,*,李 梅3,魏 曉3

(1.四川農業大學 生命科學學院,四川雅安 625014;2.四川農業大學 理學院,四川雅安 625014;3.四川農業大學 林學院,四川雅安 625014)

采用響應面法優化超聲波輔助提取山蒼子揮發油的工藝條件。在單因素實驗的基礎上,選擇提取時間、液固比、超聲時間為影響因素,應用Box-Behnken中心組合進行3因素3水平的實驗設計,以山蒼子揮發油得率作為響應值,進行響應面分析(RSM)。結果表明:超聲波法提取山蒼子揮發油的最佳提取條件為:提取時間3.4h、液固比18∶1(mL/g)、超聲時間12min,驗證值為5.33%。同時采用氣相色譜-質譜法(GC-MS)對揮發油進行成分分析,從揮發油中共分離出25個色譜峰,鑒定出21個化合物,檢出率為98.97%,萜類化合物15個,GC含量為83.50%,其中(Z)-檸檬醛、(E)-檸檬醛、檸檬醛,是山蒼子果實的特征性香氣成分。

山蒼子揮發油,超聲波提取,響應面法,氣相色譜-質譜(GC-MS),香氣成分

山蒼子(Litseacubeba)為樟科(Lauraceae)木姜子屬(Litsea)落葉灌木或小喬木[1]。主要分布于長江以南等省,迄今仍以野生為主,我國山蒼子資源豐富,是山蒼子揮發油生產及出口大國[2]。山蒼子的葉、花和果實均含有以檸檬醛為主的揮發性芳香成分,經水蒸汽蒸餾可制取揮發油[3]。山蒼子揮發油成分復雜,主要是萜、烯、醛、酮、醇類,以萜類含量最高[4],廣泛用于食品、醫藥、農藥、化妝品等行業,是我國傳統的林產化工產品[5]。鮮果揮發油是香料工業中合成紫羅蘭酮等香料的重要原料,也是我國食品添加劑中的增香劑[6]。

山蒼子果實揮發油常見的提取方法,已見文獻報道的有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑提取法、壓榨法、超臨界二氧化碳萃取法等[7-10]。水蒸氣蒸餾法是傳統工業生產方法,但其得率低品質差;溶劑提取法易造成殘留多不穩定等問題;壓榨法雜質多出油率低;超臨界二氧化碳萃取技術得率高殘留低,但工藝復雜成本高，使這種方法只能局限于實驗室研究[11-13]。超聲波提取法具有操作簡便、提取效率高等優點,已被廣泛用于植物次生代謝產物的提取[14-18],但關于山蒼子揮發油超聲波提取法的研究未見報道。響應面法(RSM)能以最經濟的方式,用相對較少的時間對實驗進行全面的研究,廣泛應用于優化提取工藝等領域,但采用響應面法優化山蒼子中揮發油提取條件的研究尚屬空白。因此,本研究采用響應面法(RSM)對超聲波輔助提取山蒼子果實中揮發油的工藝進行優化,并同時對其揮發油進行GC-MS測定,確定山蒼子揮發油的特征性香氣成分,以期提高山蒼子揮發油的得率,為其開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山蒼子鮮果2013年7月采自重慶市萬州山蒼子種植基地,基地位于海拔800米左右的山坡上,經四川農業大學林學院李梅教授鑒定為樟科木姜子屬植物山蒼子(Litseacubeba),采集后-20℃冷藏備用。

Agilent 7890A/5975C氣質聯用儀 美國安捷倫科技公司;KQ-300GDV型恒溫數控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器廠;BUCHI R-3旋轉蒸發儀 瑞士Buchi有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 河南鞏義英峪儀器廠;DZTW電子調溫電熱套 北京永光明醫療儀器有限公司;BT124s電子天平 Sartorius公司;揮發油提取裝置;玻璃注射器等。無水硫酸鈉,正己烷等均為分析純 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 山蒼子揮發油超聲波輔助提取工藝 準確稱取10g山蒼子鮮果置于圓底燒瓶中,按照一定液固比加水,振蕩混勻后置于超聲波清洗器中(超聲頻率40kHz、輸出功率600W)進行超聲波處理一定的時間,使植物細胞壁破碎,然后將圓底燒瓶放入電熱套并連接冷凝管及揮發油提取器,回流提取。揮發油經無水硫酸鈉干燥后于-4℃保存待用[19-20]。

揮發油得率(%)=揮發油質量/山蒼子鮮果質量×100

1.2.2 單因素實驗 以山蒼子揮發油得率為指標,研究提取時間(1、2、3、4、5h)、液固比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1mL/g)、超聲時間(0、5、10、15、20min)對得率的影響,篩選影響提取結果的各因素最佳提取條件。

1.2.3 響應面實驗設計優化 在單因素實驗結果的基礎上,采用Box-Behnken design(BBD)對超聲波輔助水蒸氣提取進行響應面優化,以提取時間(A)、液固比(B)、超聲時間(C)為自變量,以山蒼子揮發油得率(Y)為響應值,設計三因素三水平表,實驗設計如表1。

表1 響應面分析因素及水平表

1.2.4 山蒼子揮發油香氣成分的GC-MS分析 氣相色譜條件:HP-5 MS 5% Phenyl Methyl Silox(30m×0.25mm,0.25μm)色譜柱,載氣為高純度氦氣(99.999%),分流比為20∶1,分流流量20mL/min,流速1mL/min。升溫程序:進樣量1μL,從50℃開始,保持1min,以5℃/min 升至 250℃,保持4min。

質譜條件:電子轟擊(electron impact,EI)離子源,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,電子能量70eV,溶劑延時5min,掃描范圍:40～550amu。

1.3 數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值,應用Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0、Design Expert 8.0對數據進行處理、分析和作圖。供試揮發油樣香氣成分根據GC-MS分析得到的各色譜峰,通過計算機譜庫檢索(Wiley和NIST庫),結合相對保留時間,查閱相關文獻進行定性,鑒定出21種主要的揮發性成分,最終根據香氣成分的峰面積值相對定量。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對山蒼子揮發油得率的影響 由圖1a可見,隨著提取時間的延長,揮發油的得率先增大后減小,3h時揮發油的得率為最大值3.89%。這可能是由于隨著時間的延長,山蒼子果皮細胞中的揮發油成分不斷被溶出,使得率上升,但是提取時間超過3h之后,揮發油類成分已經基本溶出,得率趨于平緩,繼續延長時間得率增加緩慢。所以通過單因素實驗選擇提取時間為3h左右。

2.1.2 液固比對山蒼子揮發油得率的影響 從圖1b可以看出,揮發油得率隨著液固比的增大而升高,液固比超過20∶1之后,揮發油得率明顯下降。這可能是物料與溶劑之間擴散已經達到平衡,再繼續增加溶劑量已不能提取出更多的揮發油。所以通過單因素實驗選擇液固比為20∶1mL/g左右。

2.1.3 超聲時間對山蒼子揮發油得率的影響 由圖1c可見,超聲波處理時間延長,揮發油得率增加,當時間延長至10min后,揮發油得率隨著時間延長有所降低,這可能是由于超聲波在10min內對細胞膜的破壞作用較大,溶出物多,得率高,但超聲波作用時間太長可能會使提取物中部分精油結構受到破壞。因此,為了保證有效成分結構完好且提取完全,所以選擇提取時間為10min左右。

圖1 提取時間、液固比及超聲時間對山蒼子揮發油得率的影響Fig.1 Effects of extracting time,ratio of liquid to solid and ultrasound time on extraction yield of volatile oil from Litsea Cubeba

2.2 響應面法優化超聲波輔助提取山蒼子揮發油工藝

2.2.1 響應面實驗設計及結果 根據設計進行實驗,結果見表2。

采用design expert 8.0軟件對所得數據進行多元回歸擬合,得模型表達式如下:

Y=5.63+0.51A-0.12B+0.20C+9.750×10-3-0.03AB-0.17AC-0.043BC-1.18A-0.31B-0.37C

對該模型采用方差分析(analysis of variance,ANOVA),分析結果見表3。由表3可知,整體模型達極顯著水平(p<0.01),表明該二次方程模型高度顯著。模型的失擬項(p>0.05)不顯著,方程的相關系數R2= 0.9743,說明該方程對實驗擬合較好[21-22],可用于山蒼子揮發油提取工藝實驗的預測。另外,該模型的變異系數CV=1.9%,在可接受范圍內[23-24]。A、B、C、A2、B2、C2影響極顯著,AC極顯著。同時說明各實驗因素對揮發油得率的影響不是簡單的線性關系,簡單的分析方法難以解析,響應面法能夠較好的描述它們之間的關系,并能較好的優化揮發油的提取工藝。

表2 響應面實驗設計及結果

2.2.2 響應面分析 根據回歸方程,做出響應面和等高線的分析圖,分析各因素對響應值的影響及各因素之間的交互作用,如圖2所示。等高線的形狀可以反映出交互作用的強弱,橢圓形表明交互作用顯著,而圓形則與之相反,有閉合的橢圓或圓形則表明有極大值[25]。圖2a顯示了液固比為20∶1mL/g,超聲時間和提取時間之間的交互作用對揮發油得率的影響;兩者的3D圖曲線最陡,等高線橢圓弧度最大,說明了提取時間與超聲時間的交互效應最為顯著。圖2b顯示了超聲時間為10min,液固比與提取時間之間的交互作用對揮發油得率的影響;其3D圖曲線較為平滑,等高線偏圓形,說明了液固比與提取時間的交互效應不顯著。圖2c顯示了提取時間3h,超聲時間和液固比之間的交互作用對揮發油得率的影響;兩者的3D圖最為平滑,等高線幾乎為圓形,說明了超聲時間和液固比的交互效應不顯著。在本實驗中,提取時間是影響揮發油得率的最重要因素,次之是超聲時間,料液比影響最小。

表3 回歸方程模型顯著性分析表

圖2 Y=f(A,C)(a)、Y=f(A,B)(b)及Y=f(B,C)(c)的響應面圖和等高線圖Fig. 2 Responsive surfaces and contour plots of Y=f(A,C)(a),Y=f(A,B)(b)andY=f(B,C)(c)

注:表中**為極顯著(p<0.01),*為顯著(p<0.05)。

2.2.3 回歸模型的驗證實驗 通過得出的模型,確定超聲波輔助提取山蒼子揮發油的最佳條件為提取時間3.44h、液固比17.96∶1mL/g、超聲時間12.34min,在此條件下,預測山蒼子揮發油得率達5.72045%。考慮到實驗操作的可行性,將最佳工藝條件修改為提取時間3.4h、液固比18∶1mL/g、超聲時間12min。為了檢驗模型預測的準確性,按上述最佳條件進行提取,實驗重復3次進行。平均得率為5.33%,與預測值基本一致;說明該方程與實際情況擬合很好,充分驗證了所建模型的正確性。本實驗采用的方法優化了提取的工藝條件,并提高了揮發油的得率達5.33%,優于傳統提取方法[26-28]。

2.3 重慶萬州產山蒼子揮發油的GC-MS分析

采用GC-MS聯用技術,對最優條件下超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的山蒼子揮發油進行分離,得到揮發油的總離子流圖,如圖3所示。

圖3 山蒼子揮發油總離子流程圖Fig.3 Total ions chromatogram(TIC) of volatile oil from Litsea Cubeba

經計算機數據處理和NIST-08質譜圖庫檢索,并按峰面積歸一化法計算各組分的GC含量,結果見表4,從山蒼子揮發油中共檢測出25個色譜峰,初步鑒定了21個化合物,鑒出率為98.97%。

萜類是植物界中廣泛存在的一類次生代謝產物,其中單萜和倍半萜主要是以揮發性物質存在于植物體的腺細胞和表皮當中,具有濃郁的木香、花香和甜香[29]。在已鑒定成分中萜類物質有15個,GC含量為83.50%,是揮發油的主要成分;其中單萜成分及其衍生物為12個,GC含量為80.11%;倍半萜及其衍生物3個,GC含量為3.39%。在萜類物質中無環單萜含氧衍生物(Z)-檸檬醛、(E)-檸檬醛、檸檬醛GC含量最高,達到68.53%,所以根據本實驗結果,(Z)-檸檬醛、(E)-檸檬醛、檸檬醛為重慶萬州山蒼子的特征性香氣成分,這個結果與已有相關文獻中各地不同品種山蒼子的特征性香氣成分相一致[30-32]。

3 結論

本實驗在單因素實驗的基礎上,將響應面法應用于優化山蒼子精油的超聲波輔助提取條件,依據回歸分析和驗證實驗結果可知,此方法合理可行。得到山蒼子揮發油超聲波輔助提取的最佳提取工藝為:提取時間3.4h、液固比18∶1(mL/g)、超聲時間12min,在此條件下,實際得率5.33%,與模型理論預測值5.72%相比相對誤差僅為0.39%。因此采用響應面法的揮發油超聲波提取工藝優化條件,對改進現有山蒼子揮發油的提取工藝、提高揮發油生產的經濟效益具有一定的理論指導意義。

采用超聲波輔助提取的山蒼子揮發油,經GC-MS分離和鑒定共檢測出25個色譜峰,初步鑒定了21個化合物,鑒出率為98.97%。在檢出成分中,其中(Z)-檸檬醛、(E)-檸檬醛、檸檬醛含量最高,達68.53%,因此鑒定(Z)-檸檬醛、(E)-檸檬醛、檸檬醛為重慶萬州山蒼子的特征性香氣成分,為山蒼子揮發油的深加工產業提供理論依據。

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Optimization of the ultrasound assisted extraction of volatile oil fromLitseaCubebaand analysis by GC-MS

LI Wen-shuang1,JIANG Xiao-bo1,WANG Tao1,JIANG Yuan-yuan1,ZHANG Li2,*,LI Mei3,WEI Xiao3

(1.College of Life Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.College of Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;3.College of Forestry,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Response surface analysis methodology(RSM)was used for optimizing ultrasound-assisted extraction of volatile oil fromLitseaCubeba. Based on single-factor experiments,three independent variables including extracting time,solvent-solidratio and ultrasound time,were selected as affecting factors during extraction. The experiments were arranged according to Box-Behnken central composite experiment design. Response surface analysis method was applied to determine the effect of central composite experiment design. The results showed that the optimum ultrasound extraction conditions for volatile oil fromLitseaCubebawere as follow:extraction time 3.4h,ratio of liquid to solid 18∶1(mL/g)and ultrasound time 12min. While the actual extraction yield was 5.33%. The volatile oil was analyzed by GC-MS,25 peaks were separated and 21 compounds which accounted for 98.97% of GC were identified. The result showed,that among 21 compounds,15 compounds are terpines. Among all of the chemical constituents of volatile oil fromLitseaCubeba,three isomers of Citral(z)-3,7-Dimethylocta-2,6-octadiena,(E)-3,7-Dimethyl-2,6-octadienal and 3,7-Dimethyl-2,6-octadiena were the characteristic aroma constituent for fruits ofLitseaCubeba.

volatile oil fromLitseaCubeba;ultrasonic extraction;response surface analysis methodology;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);aroma components

2014-06-13

李文爽(1988-)，女，碩士研究生，研究方向:植物化學成分分析。

*通訊作者:張利(1969-)，女，博士，教授，研究方向:植物化學與成分分析。

四川省科技型中小企業技術創新基金項目(13CX02806098);國家科技部農業科技成果轉化基金項目(2012GB2F000385);國家科技部科技型中小企業技術創新基金項目(12C26215105863);成都市科技型中小企業技術創新基 金項目(11CXYB958JH-003)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)07-0308-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.056