HPLC-UV-CL聯(lián)用研究霍山石斛生物堿清除自由基活性

陳乃東,李 俊,金 暉,陳 瓊,朱慶杰

(1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,安徽六安 237012;2.皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心,安徽六安 237012;3.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,安徽合肥 230032)

HPLC-UV-CL聯(lián)用研究霍山石斛生物堿清除自由基活性

陳乃東1,2,3,李 俊3,*,金 暉1,陳 瓊1,朱慶杰1

(1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,安徽六安 237012;2.皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心,安徽六安 237012;3.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,安徽合肥 230032)

目的:霍山石斛生物堿抗氧化活性成分在線測(cè)定,為霍山石斛藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及抗氧化活性物質(zhì)快速發(fā)現(xiàn)提供依據(jù);方法:在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上建立霍山石斛生物堿部位HPLC-UV分析方法,采用魯米諾-雙氧水發(fā)光體系作為羥自由基供體、以校正清除率為抗氧化活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),HPLC-UV-CL聯(lián)用在線測(cè)定霍山石斛生物堿部位各組分清除羥自由基活性。以磷鉬酸、碘-碘化鉀為沉淀試劑敲出總生物堿提取物中生物堿組份,對(duì)比敲出前后HPLC圖譜變化,確定霍山石斛的生物堿組分。結(jié)果:在本實(shí)驗(yàn)條件下,霍山石斛中檢出4種生物堿峰6、峰10、峰11、峰14,其中峰14、峰11具有一定的清除羥自由基活性,校正清除率達(dá)4.95%和10.94%。峰6、峰10對(duì)魯米諾-雙氧水系統(tǒng)發(fā)光值無(wú)明顯影響。結(jié)論:HPLC-UV-CL可用于霍山石斛生物堿清除自由基活性快速測(cè)定。

霍山石斛,高效液相-化學(xué)發(fā)光聯(lián)用,清除羥自由基活性,生物堿

3.School of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei 230032,China)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng),俗稱米斛,為蘭科石斛屬多年生草本植物,局限分布于大別山區(qū)的安徽霍山、金寨、岳西、舒城,湖北英山等縣,含有多糖[1]、生物堿[2]和黃酮[3]等,具有增強(qiáng)免疫活性[4-5]、明目、抗氧化等功效[6],為安徽道地藥材之一。

大量研究表明中藥的許多功效與其抗氧化作用密切相關(guān)[7-8],快速發(fā)現(xiàn)中藥中抗氧化活性成分對(duì)于闡明中藥的作用機(jī)制和中藥新藥創(chuàng)制具有重要意義。傳統(tǒng)中藥活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)多采用先分離得到的單一化合物再進(jìn)行活性測(cè)定的方式,然而,這種先分離再測(cè)定活性的方法盲目性較大,研究成果的取得帶有很大的偶然性,效率極為低下。針對(duì)上述弊端,本實(shí)驗(yàn)擬從霍山石斛抗氧化活性入手,采用HPLC-UV-CL聯(lián)用對(duì)霍山石斛總生物堿提取物抗氧化活性在線測(cè)定以快速發(fā)現(xiàn)霍山石斛中存在的抗氧化活性物質(zhì),為后續(xù)的抗氧化活性物質(zhì)的定向分離、霍山石斛的譜效關(guān)系及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),為探討新的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料霍山石斛,2013年10月采自安徽霍山,品種經(jīng)植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心陳乃富教授鑒定為霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)。

甲醇 AR,上海振興化工一廠;色譜甲醇 上海星可生化有限公司;色譜乙腈 上海星可生化有限公司;磷酸 上海振起化學(xué)試劑有限公司;二乙胺 汕頭市西隴化工廠有限公司;二氯甲烷,三氯甲烷 西隴化工股份有限公司;磷鉬酸,雷氏銨鹽,碘化鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;碘化汞鉀 貴州銅仁化學(xué)試劑廠出品。

高效液相色譜儀:Waters1525 HPLC色譜儀(Breeze工作站、Waters2487雙通道紫外檢測(cè)器,美國(guó));化學(xué)發(fā)光儀 西安瑞邁。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 60℃烘干至恒重的霍山石斛,粉碎,精密稱取10.0g,放入圓底燒瓶中,加入95%甲醇溶液50mL,60℃水浴冷凝回流浸提3次,每次3h,合并濾液,減壓濃縮至干,殘?jiān)苡?%的鹽酸溶液,等體積二氯甲烷萃取3次,酸水相加氨水調(diào)pH至10.0,等體積氯仿萃取3遍,回收氯仿獲總生物堿提取物,溶于色譜甲醇配成2.5mg/mL溶液,0.45μm微孔濾膜過(guò)濾、備用。

1.2.2 HPLC-UV-CL在線分析中HPLC條件 參照相關(guān)文獻(xiàn)[9],經(jīng)過(guò)反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn),確定霍山石斛總生物堿HPLC檢測(cè)條件為:Kromasil ODS C18柱;流動(dòng)相0.02mol/L二乙胺溶液(A相)-乙腈(B相),梯度洗脫,0～8.0min,20% B,8.0～10.0min,20%～30% B,10.0～17.0min,30% B,17.0～30.0,30%～45% B,30.0～33.0min,45%～50%,33.0～40.0min,50% B,40.0～42.0min,50%～65% B,42.0～48.0min,65% B,48.0～50.0min,65%～80% B,50.0～57.0min,80% B,57.0～60.0min,80%～100% B,60.0～73.0min,100% B,73.0～76.0min,100%～20% B,76.0～86.0min,20% B,流速0.6mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)240nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量20μL。

1.2.3 HPLC-UV-CL在線分析中CL條件 參考余伯陽(yáng)[10-12]、李萍[13]等方法,在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[14],采用魯米諾-雙氧水發(fā)光體系在線評(píng)價(jià)霍山石斛生物堿部位清除羥自由基活性。主要測(cè)定條件如下:

碳酸鹽緩沖液:0.1mol·L-1NaHCO3水溶液以0.1mol·L-1Na2CO3碳酸鈉水溶液調(diào)pH至10.0,0.45μm微孔濾膜過(guò)濾、備用。

H2O2溶液:精密量取30% H2O2溶液加雙蒸水稀釋成1.0×10-5mol/L的H2O2溶液0.45μm微孔濾膜過(guò)濾、備用。

魯米諾溶液:精密稱取魯米諾碳酸鹽緩沖液稀配制成1.8×10-5mol/L魯米諾溶液,0.45μm微孔濾膜過(guò)濾、備用。

以雙蒸水為空白對(duì)照。

1.2.4 抗氧化活性計(jì)算方法 在丁曉萍等[10]方法的基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)采用校正清除率評(píng)價(jià)HPLC-UV-CL在線測(cè)定時(shí)各組分對(duì)羥自由基的清除能力,校正清除率指HPLC分離的組分峰,其1%峰面積所代表的質(zhì)量對(duì)自由基的清除活性,計(jì)算方法如下:

校正清除率(%)=(CL空白-CL本底)-(CL樣品-CL本底)/(CL空白-CL本底)×(Area%×100)×100

式中,CL空白為空白對(duì)照組的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度;CL本底為本底組的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度;CL樣品為樣品組的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度;Area%為HPLC樣品峰的峰面積比例。校正清除率越高,表明樣品清除自由基能力越強(qiáng)。

1.2.5 霍山石斛生物堿組分的沉淀敲除——生物堿組分定性分析 實(shí)驗(yàn)采用磷鉬酸、碘-碘化鉀[15]作為霍山石斛生物堿的沉淀試劑,精密吸取配制的2.5mg/mL總生物堿部位溶液0.5mL,與沉淀試劑等體積混合,搖勻,10℃下10000r/min離心10.0min,上清液即為敲除了生物堿組份的總生物堿提取液,與2.1測(cè)定的總生物堿提取物的HPLC結(jié)果相比較,確定霍山石斛生物堿組份峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 霍山石斛總生物堿提取物的HPLC-UV檢測(cè)結(jié)果

霍山石斛總生物堿提取物的HPLC結(jié)果如圖1所示。在本實(shí)驗(yàn)條件下,HPLC譜上顯示15個(gè)組分峰(peak1～peak15),但無(wú)法確定生物堿組份峰。

圖1 霍山石斛總生物堿部位HPLC特征圖譜Fig.1 The reference standard chromatograms of total alkloid extraction from the stems of D. huoshanese

2.2 霍山石斛總生物堿提取物生物堿組分的定性分析

樣品加入沉淀試劑磷鉬酸后(圖2b),與未加沉淀試劑時(shí)霍山石斛HPLC圖譜(圖2a)及沉淀試劑磷鉬酸空白(圖2c)對(duì)照對(duì)比,HPLC色譜峰6的AU值顯著降低;色譜峰10、峰11、峰14信號(hào)消失,提示霍山石斛生物堿部位的HPLC組分峰中的峰6、峰10、峰11、峰14可能為生物堿組分峰(圖2)。

圖2 霍山石斛生物堿部位生物堿組分磷鉬酸沉淀敲出結(jié)果Fig.2 The HPLC chromatograms of knocked-out alkloids extraction from D. huoshanese by phosphomolybdic acid注:a.霍山石斛總生物堿部位HPLC圖譜;b.霍山石斛總生物堿部位以磷鉬酸沉淀敲除生物堿后HPLC圖;c.磷鉬酸空白對(duì)照。

沉淀試劑碘-碘化鉀對(duì)霍山石斛生物堿組分沉淀敲出結(jié)果如圖3b所示,與霍山石斛生物堿部位HPLC圖譜(圖3a)、沉淀試劑空白(圖3c)對(duì)照對(duì)比,生物堿部位HPLC圖譜色譜峰6、峰10、峰11、峰14消失,與磷鉬酸沉淀敲出結(jié)果一致,證明為HPLC圖譜色譜峰6、峰10、峰11、峰14為霍山石斛的生物堿組分峰(圖3)。

圖3 霍山石斛生物堿部位生物堿組分碘-碘化鉀沉淀敲出結(jié)果Fig.3 The HPLC chromatograms of knocked-out alkloids extraction from D. huoshanese by iodine-potassium iodide注:a.霍山石斛總生物堿部位HPLC圖譜;b.霍山石斛總生物堿部位以碘-碘化鉀沉淀敲除生物堿后HPLC圖;c.磷鉬酸空白對(duì)照。

2.3 霍山石斛總生物堿提取物的HPLC-UV-CL在線檢測(cè)結(jié)果

分析CL圖譜與HPLC圖譜,HPLC檢出霍山石斛總生物堿提取物檢出的15種組分,對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響存在明顯差異(圖4):在本實(shí)驗(yàn)條件下,僅有8個(gè)組分(峰1、峰3、峰4、峰11、峰12、峰13、峰14、峰15)可使魯米諾-雙氧水系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度下降,有7個(gè)組分峰(峰2、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10)未檢測(cè)到明顯的發(fā)光抑制活性,提示霍山石斛生物堿部位15種成分對(duì)羥自由基清除能力存在差異。8個(gè)發(fā)光抑制組分對(duì)魯米諾-雙氧水系統(tǒng)中羥自由基的校正清除率如表1所示。組分峰4對(duì)羥自由基的校正清除率最高,達(dá)14.81%,其次是峰14,校正清除率達(dá)10.94%。

值得注意的是,CL峰16′,在HPLC上并未檢測(cè)到相應(yīng)的組分峰16,可能是峰16所代表的物質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的HPLC-UV色譜條件(λ=240nm)下無(wú)吸收所致,提示HPLC-UV-CL在線測(cè)定活性時(shí)波長(zhǎng)選擇對(duì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響。

表1 霍山石斛生物堿部位各組分清除羥自由基活性HPLC-UV-CL在線測(cè)定結(jié)果

圖4 霍山石斛HPLC-UV-CL測(cè)定結(jié)果Fig.4 Chromatographic and antioxidant activity fingerprints of scavenging H2O2

綜合HPLC-UV-CL檢測(cè)結(jié)果及霍山石斛生物堿組分沉淀敲出結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)條件下,可從霍山石斛中檢測(cè)到4種生物堿(峰6、峰10、峰11、峰14),其峰面積比例從大到小依次為峰6、峰10、峰11、峰14,其中峰6峰面積最大,約為峰14的6倍。4種霍山石斛生物堿對(duì)魯米諾-雙氧水系統(tǒng)的羥自由基表現(xiàn)出不同的清除活性,峰14生物堿活性最強(qiáng),對(duì)羥自由基的校正清除率達(dá)10.94%,而含量較高的峰6和峰10所代表的生物堿未檢測(cè)到明顯的羥自由基清除活性。

3 結(jié)論與討論

采用HPLC-UV-CL在線測(cè)定中藥提取物的活性,如何評(píng)價(jià)HPLC分離的各組分——尤其是未知組分的活性是一難題。HPLC分離的組分中,在CL譜上對(duì)發(fā)光抑制高的組分,其抗氧化活性不一定高,因?yàn)镃L測(cè)定的是HPLC分離的組分總抗氧化活性,CL測(cè)定的發(fā)光抑制強(qiáng)度高的組分可能由于該組分含量高所致,在以CL發(fā)光抑制在線評(píng)價(jià)HPLC組分活性時(shí),應(yīng)考慮各組分的含量對(duì)活性的影響。實(shí)驗(yàn)引入校正清除率的概念,采用各組分的1%峰面積對(duì)自由基的清除率作為在線評(píng)價(jià)物質(zhì)活性的指標(biāo),對(duì)于母核結(jié)構(gòu)相似、在選定的檢測(cè)波長(zhǎng)下摩爾消光系數(shù)相近的物質(zhì),校正清除率大小反映了物質(zhì)抗氧化活性大小。本實(shí)驗(yàn)采用校正清除率用于霍山石斛中不同生物堿組分的清除自由基活性進(jìn)行在線評(píng)價(jià),結(jié)果基本能反映各組分的抗氧化活性差異。采用HPLC-UV-CL在線測(cè)定方法,以校正清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo),可從含有結(jié)構(gòu)類似物的中藥中快速發(fā)現(xiàn)抗氧化活性物質(zhì)。然而,對(duì)于化學(xué)結(jié)構(gòu)及消光系數(shù)相差較大的組分,峰面積相同的兩個(gè)組分,其代表的物質(zhì)含量相差較大,以峰面積大小代表不同物質(zhì)含量,誤差較大,導(dǎo)致校正抑制率評(píng)價(jià)抗氧化活性誤差也較大,因此,HPLC-UV-CL不適宜結(jié)構(gòu)、消光系數(shù)相差較大的化合物抗氧化活性比較。

霍山石斛雖長(zhǎng)期用于醫(yī)藥保健,由于瀕臨滅絕,對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究因缺乏實(shí)驗(yàn)材料而尚處于起步階段,作為石斛類藥材主要活性成分之一的生物堿,在霍山石斛含量極低,僅為其干重的0.03%[16],目前尚未有從霍山石斛中分離到生物堿類化合物研究報(bào)道,導(dǎo)致霍山石斛品質(zhì)研究、甚至質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建因缺乏標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品而陷于困境。因此,我們對(duì)霍山石斛生物堿部位的各組分抗氧化活性在線測(cè)定結(jié)果對(duì)于探討霍山石斛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、快速發(fā)現(xiàn)抗氧化活性成分及闡明霍山石斛藥物作用機(jī)制具有重要參考價(jià)值,為構(gòu)建可反映霍山石斛化學(xué)成分指紋特征,又體現(xiàn)生物活性信息的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供前期研究基礎(chǔ)。

此外,在本實(shí)驗(yàn)中,我們首次嘗試將生物堿沉淀鑒定用于中藥提取物中生物堿組分定向敲除,并與HPLC檢測(cè)相結(jié)合,通過(guò)對(duì)比沉淀前后HPLC組分峰的變化確定霍山石斛未知生物堿組分,該方法對(duì)缺乏生物堿標(biāo)準(zhǔn)品的珍稀瀕危中草藥未知生物堿的定性分析及基于生物堿的天然藥物質(zhì)量控制具有一定參考價(jià)值。

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Cleaving hydroxyl radicals activity of the alkaloids fromDendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng detected by on-line HPLC-UV-CL system

CHEN Nai-dong1,2,3,LI Jun3,*,JIN Hui1,CHEN Qiong1,ZHU Qing-jie1

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,West Anhui University,Lu’an 237012,China;2. West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine,West Anhui University,Lu’an 237012,China;

Objective:To explore the on-line detecting on the anti-oxidant activity of the alkaloids from the stems ofDendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng by HPLC-UV-CL system,and provide references on researching the potency material base ofD.huoshanenseand on quick discovery of antioxidants from Traditional Chinese Medicine. Method:Applying the on-line HPLC-UV-CL analysis with Luminol-perhydrol chemiluminescence system as the donor of hydroxyl radicals to evaluate the anti-oxidant activity of the constituents of the total alkaloid extraction fromD.huoshanense. The alkaloids were identified by knocking-out the alkaloid components using phosphomolybdic acid and iodine-potassium iodide as precipitation reagent. Result:Total four kinds ofD.huoshanensealkaloids(the HPLC peak 6,peak 10,peak 11 and peak 14)were checked out and peak 14 and peak 11 showed remarkable hydroxyl-radical-cleaning activity with the calibration clearance values 10. 94% and 4.95%,respectyively. No effect of the other twoD.huoshanensealkaloids(peak 6 and peak 10)on the chemiluminescence value of Luminol-perhydrol system were determined by the established on-line HPLC-UV-CL method. Conclusion:The on-line HPLC-UV-CL system could be used to evaluate the cleaving hydroxyl radicals activity ofD.huoshanensealkaloids.

Dendrobiumhuoshanense;cleaving hydroxyl radicals activity;chemiluminescence(CL);alkaloids

2014-06-13

陳乃東(1972-)，男，博士，副教授，主要從事天然藥物活性成分分離鑒定、中藥與天然藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制研究。

*通訊作者:李俊(1960-)，男，博士，教授，主要從事抗炎免疫藥理學(xué)、臨床藥理學(xué)、生物藥劑學(xué)和天然藥物活性研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(81274021);中國(guó)博士后基金(2014M551791);安徽省人事廳博士后研究項(xiàng)目;安徽高校省級(jí)科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2012A277);六安市定向委托皖西學(xué)院市級(jí)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2011LWA001);皖西學(xué)院研究性學(xué)習(xí)項(xiàng)目(WXXYX2013063，WXXYX2013055，WXXYX2013080)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)07-0276-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.050