小球藻保健飲料的研制

龐庭才,胡上英,熊 拯,鄧冬玲,李麗燕

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室，廣西欽州 535099;2.北部灣海洋生物資源開發與保護重點實驗室，廣西欽州 535099；3.欽州學院,廣西欽州 535099)

小球藻保健飲料的研制

龐庭才1,2,3,胡上英3,熊 拯3,鄧冬玲1,2,3,李麗燕3

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室，廣西欽州 535099;2.北部灣海洋生物資源開發與保護重點實驗室，廣西欽州 535099；3.欽州學院,廣西欽州 535099)

以小球藻粉為原料,采用超聲波輔助提取藻多糖,再利用木瓜蛋白酶與中性蛋白酶進行水解藻蛋白,合并濾液后,按一定比例添加適量蜂蜜、白糖、檸檬酸直接配制澄清型小球藻保健飲料。通過正交實驗確定提取藻多糖的最佳工藝為:料液比1∶15(g∶mL),pH7,溫度60℃,時間30min,小球藻多糖提取得率為18.94mg/g。水解藻蛋白的最佳工藝為:底物濃度100g/L,混合酶量12000U/g,pH6.5,溫度55℃,小球藻蛋白水解度達27.83%。研制成的產品營養豐富、風味獨特,是一款老少皆宜的營養保健飲品。

小球藻,多糖,蛋白質,飲料

小球藻(Chlorellasp.)屬于單細胞綠藻[1],分布廣泛,生物量大,富含蛋白質、維生素、礦物質等人體不可缺少的營養素,特別是糖蛋白、多糖以及核酸等物質,具有激活淋巴細胞、增強免疫力、抵抗外來疾病的入侵、促進人體受傷組織修復等功效[2-5]。小球藻是全世界微藻產業中產量最多的品種,全世界年產量2000噸,主要生產地為東南亞地區[6]。目前,在食品領域對小球藻的加工,主要是將其經過熱處理和破壁處理直接制成小球藻片、顆粒劑或膠囊[7]。而小球藻粉本身存在著特殊的藻腥味,因此制成其他食品如:面包、面條、餅干等時,雖然營養豐富,往往由于品相和濃郁的腥味不被大眾消費者所接受[8]。本文采用超聲波輔助提取小球藻多糖,再選用雙酶法水解小球藻蛋白,合并濾液后進行調配,從而研制出氣味清新、口感獨特、營養豐富且具有一定保健功效的小球藻飲料。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

小球藻粉 青島恒達精益貿易有限公司;木瓜蛋白酶 白色,粉狀,6萬U/g,南寧東恒華道生物科技有限責任公司;中性蛋白酶 白色,粉狀,5萬U/g,南寧東恒華道生物科技有限責任公司;白糖 湛江市金豐糖業有限公司;食品級檸檬酸 濰坊英軒實業有限公司。葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇均為分析純 廣東光華化學廠有限公司。

EL204分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;EL20酸度計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;VGT-1990QTD超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;V-1800PC型可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇科析儀器有限公司;H-1850臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 工藝流程

1.3 小球藻多糖的提取

1.3.1 小球藻多糖提取的單因素實驗 按設定的料液比加入小球藻粉和水,在設定的pH和溫度下超聲波輔助提取,經設定時間后,5000r/min離心15min,過濾,濾液加入3倍體積85%乙醇進行沉淀,然后再過濾,將沉淀用無水乙醇洗滌2次,沉淀為藻多糖。將藻多糖溶于蒸餾水中并定容至100mL,測定多糖含量。每次處理重復測定3次,結果取平均值。單因素實驗考察料液比、提取溫度、提取時間和pH4個因素對多糖提取效果的影響:

料液比的選擇:溫度50℃、時間30min、pH7,料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g∶mL)。

溫度的選擇:時間30min、pH7、料液比1∶20(g∶mL),溫度分別為40、50、60、70、80℃。

時間的選擇:溫度60℃、pH7、料液比為1∶20(g∶mL),時間分別為20、25、30、35、40min。

pH的選擇:溫度60℃、時間30min、料液比1∶20(g∶mL),pH3、5、7、9、11。

1.3.2 小球藻多糖提取正交實驗 在單因素實驗基礎上設計L9(34)正交實驗(見表1),以考察料液比、提取溫度、提取時間和pH 4個因素對藻多糖提取效果的影響,以確定最佳提取工藝。

表1 藻多糖提取正交水平表

1.3.3 多糖提取得率測定 以葡萄糖為標準系列采用苯酚-硫酸法[9-10]測定多糖含量,再按式(1)計算樣品中多糖含量:

多糖提取得率計算公式如下:

式(1)

式中:C-從標準曲線上查出的多糖質量濃度,mg/g;N--樣品體積稀釋倍數;V-原樣品液體積,mL;m-樣品的質量,mg。

1.4 小球藻多肽的制備

取提多糖后的濾渣,加入100mL水,在設定的pH調節下,按設定的酶活力之比加入木瓜蛋白酶與中性蛋白酶,在設定溫度下恒溫攪拌水解3h,90℃滅酶10min,冷卻至50℃左右,于離心機中5000r/min離心15min,取上清液,即得到小球藻酶解液。

1.4.1 復合酶活力比的選取 小球藻濾渣加入純水使底物濃度為60g/L,按木瓜蛋白酶與中性蛋白酶酶活力比為1∶2、1∶1、2∶1分別加入12000 U/g的混合酶,滴加0.1mol/L NaOH溶液調節pH至7.5,置于50℃恒溫水浴中水解3h,反應過程中不斷加NaOH溶液使pH恒定。以水解度(DH)為指標,確定最佳復合酶活力比。

1.4.2 小球藻多肽制備的單因素實驗 小球藻多肽制備的單因素實驗,以水解度(DH)為指標,考察底物濃度、加酶量、pH和溫度4個因素對多肽制備效果的影響:

底物濃度的確定:酶活力比為2∶1,加酶量12600U/g,溫度50℃,pH7.5,底物濃度分別為60、80、100、120、140g/L。

加酶量的確定:酶活力比為2∶1,底物濃度為80g/L,溫度50℃,pH7.5,加酶量分別為12000、12600、13200、13800、14400U/g。

pH的確定:酶活力比為2∶1,加酶量12600U/g,底物濃度為80g/L,溫度50℃,pH分別為6.5,7.0,7.5,8.0,8.5。

溫度的確定:酶活力比為2∶1,加酶量12600U/g,底物濃度為80g/L,pH7.5,溫度分別40、45、50、55、60℃。

1.4.3 雙酶法水解正交實驗 在單因素實驗基礎上設計L16(45)正交實驗(見表2),考察以溫度、底物濃度、酶用量、pH 4個因素對小球藻蛋白水解效果的影響,以確定最佳的酶解工藝。

表2 酶解正交水平表

1.4.4 水解度(DH)測定 以NaOH溶液的消耗量為指標,采用pH-stat法檢測小球藻蛋白的水解度[11],用下列公式(2)計算出蛋白質的水解度。

DH(%)=VNaOH×CNaOH/(α×Mp×htot)×100

式(2)

式中:VNaOH-NaOH消耗量,mL;CNaOH-NaOH摩爾濃度,mol/L;α-大豆分離蛋白氨基的平均解離度,α=10pH-pK/(1+10pH-pk),pK可取7;Mp-蛋白質總量,g;htot-每克蛋白質中肽鍵的克當量數,取8. 38。

1.5 混合

取上述處理得到的多糖提取液和酶解液混合,攪拌均勻，冷藏備用。

1.6 灌裝與殺菌

利用灌裝設備將調配好的小球藻混合液裝瓶(100mL/瓶),置于90℃滅菌15min,冷卻即可。

2 結果與分析

2.1 多糖提取實驗結果與分析

以空白為參比,在波長490nm處測定標準液的吸光度A,以吸光度A為縱坐標,以葡萄糖標準液濃度C為橫坐標,繪制標準曲線。該標準曲線方程:Y=5.6757X+0.0067,R2=0.9999。表明葡萄糖的質量濃度在0.02～0.14mg/mL內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.1 藻多糖提取單因素實驗結果 料液比的選擇:由圖1可知,在料液比1∶20(g∶mL)時藻多糖的提取得率最高,說明水溶性藻多糖基本全部溶出。料液比高于1∶20(g∶mL)時,藻多糖提取得率都有所降低,這可能是因為小球藻多糖幾乎被全部溶出后,過多加水增大了其他雜質的大量溶出,還會使濃縮過程中多糖損失增大,從而導致小球藻多糖提取得率有所降低。因此最佳料液比選擇1∶20(g∶mL)。

圖1 料液比對藻多糖提取得率的影響Fig.1 The influence of solid-liquid ratio on the algae polysaccharide extraction rate

提取溫度的選擇:由圖2可知,提取溫度為60℃時,藻多糖提取得率達到最大。溫度低于60℃時,溫度的逐漸升高加速了藻多糖的溶出,而當超過60℃時,由于溫度過高容易導致小球藻內多糖分子結構被破壞而分解,提取得率也隨之下降,因此最佳提取溫度選擇60℃。

圖2 溫度對藻多糖提取得率的影響Fig.2 The influence of temperature on the algae polysaccharide extraction rate

提取時間的選擇:由圖3可知,當超聲處理30min 時,藻多糖提取得率達到最大值,而后隨超聲時間延長,提取量有所下降。這是由于超聲波處理能夠促使細胞組織破裂,加速溶劑與胞內物質的相互溶解滲透,但當超聲時間超過30min后,由于超聲時間過長導致多糖結構被破壞,導致提取得率有所下降。因此最佳的提取時間選擇30min。

圖3 時間對藻多糖提取得率的影響Fig.3 The influence of time on the algae polysaccharide extraction rate

pH的選擇:由圖4可知,pH7時藻多糖提取得率達到最大。pH<7時,提取量隨pH的增加而增加,提取量增加幅度較大。pH>7時,藻多糖提取得率反而有降低的趨勢。這主要是由于多糖上具有不同官能團而造成的,質子的官能團可影響多糖在不同 pH提取溶液中的親水性,導致多糖所含官能團可能會有一定的差異,使得不同pH提取溶液中多糖的提取得率有所不同[12]。因此最佳的pH選擇7。

圖4 pH對藻多糖提取得率的影響Fig.4 The influence of pH on the algae polysaccharide extraction rate

2.1.2 藻多糖提取正交實驗 由表3可知,影響小球藻多糖提取的因素大小分別是溫度(B)、pH(D)、時間(C)、料液比(A),最優提取條件為A1B2C2D2,即:料液比1∶15(g:mL),pH7,溫度60℃,時間30min,小球藻多糖提取得率為18.94mg/g,經驗證實驗證明結果與正交實驗結果相符。

表4為以對小球藻多糖提取得率影響最小的因素(料液比)為空列,對各因素對多糖提取得率的影響進行方差分析,由表4可以看出,提取溫度(B)對小球藻多糖提取得率的影響達到了非常顯著的水平(p<0.01),是影響小球藻多糖提取得率的最主要影響因素;提取時間(C)、pH(D)對小球藻對小球藻多糖提取得率的影響不顯著(p>0.05)。此項結論也印證了表3的結果。

2.2 小球藻多肽制備實驗結果與分析

2.2.1 木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的酶活力比 由圖5可知,木瓜蛋白酶與中性蛋白酶酶活力比為2∶1時水解度最大,因此選擇酶活力比為2∶1。

表3 藻多糖提取正交實驗結果

表4 方差分析表

注:“*” 表示顯著,“**”表示非常顯著。

圖5 酶活力比對水解度的影響Fig.5 The influence of enzymatic activity on the degree of hydrolysis

2.2.2 小球藻蛋白酶解單因素實驗結果 底物濃度的確定:由圖6可知,隨著反應底物濃度的增加,水解度呈先上升后下降的趨勢,底物濃度小于100g/L時,適當增加底物濃度有利于反應向生成物方向進行。當底物濃度大于100g/L時,水解度反而下降,這是因為底物濃度較大時,在不斷受熱情況下,蛋白分子易產生交鏈聚合現象,使蛋白酶分子與底物蛋白分子之間的接觸機會減少,從而導致水解度下降,影響反應速度[13]。因此,底物濃度選擇100g/L。

圖6 底物濃度對水解度的影響Fig.6 The influence of substrate concentration on the degree of hydrolysis

酶用量的確定:由圖7可知,隨著復合酶用量的增加,小球藻蛋白的水解度也有所增加,但當復合酶量大于12600U/g后,小球藻蛋白的水解度增加變緩,在12600U/g以后增大幅度趨向平緩,這可能是由于酶與底物接觸達到飽和,過多的酶之間相互抑制的原因。所以,再繼續添加水解酶,水解度將不再增加而出現下降的趨勢[14]。因此,選擇加酶量12600U/g較合適。

圖7 酶用量對水解度的影響Fig.7 The influence of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

pH的確定:由圖8可知,pH6.5時,小球藻蛋白水解度最高。這是由于酶催化反應的能力與環境pH密切相關,環境pH會影響酶分子的構象和酶分子及底物分子的解離狀態,從而影響酶的活性和酶促反應速度,pH過高、過低均對酶促反應不利。因此,選擇最佳pH為6.5。

圖8 pH對水解度的影響Fig.8 The influence of pH on the degree of hydrolysis

溫度的確定:由圖9可知,當溫度低于50℃時,隨著溫度的升高,酶促反應增強,藻蛋白水解度逐漸增大;當溫度高于50℃時,水解度有所下降。這是因為溫度對酶促反應的影響是雙效性,適宜的溫度能使酶催化反應加速,溫度過高則使得酶變性而失活,導致水解度下降。因此,選擇最適溫度為50℃。

圖9 溫度對水解度的影響Fig.9 The influence of temperature on the degree of hydrolysis

2.2.3 正交實驗結果與驗證 由表5可知,各因素對小球藻蛋白的水解度影響程度順序為D>A>C>B,即:pH、溫度、酶用量、底物濃度。pH對小球藻蛋白水解效果有顯著影響,溫度和酶用量對水解度的影響相差不大,底物濃度影響最不明顯。小球藻蛋白最佳水解方案為 A3B2C1D4,即底物濃度100g/L,混合酶用量12000U/g,pH6.5,溫度55℃。

按最優水解條件下進行驗證實驗,計算得小球藻蛋白水解度為27.83%,與正交實驗結果相符。

表5 酶解正交實驗結果

表6 方差分析表

注:“*” 表示顯著,“**”表示非常顯著。

表6為對各因素水解的影響進行方差分析,由上表可以看出,pH(D)對雙酶法水解小球藻蛋白的影響達到了非常顯著的水平(p<0.01),pH(D)成為本實驗的最主要影響因素;溫度(A)、酶用量(C)對雙酶法水解小球藻蛋白的影響達到顯著水平(p<0.05);底物濃度(B)對雙酶法水解小球藻蛋白的影響不顯著(p>0.05)。此項結論也印證了表5的結果。

3 結論

3.1 采用超聲波法提取小球藻多糖最優條件為:料液比1∶15g/mL,pH7,溫度60℃,時間30min,小球藻多糖提取得率為18.94mg/g。

3.2 采用雙酶法水解小球藻蛋白的最優條件為:底物濃度100g/L,混合酶量12000U/g,pH6.5,溫度55℃。在最優水解條件下做驗證實驗,小球藻蛋白水解度達27.83%。

3.3 在以上最優組合工藝條件下研制出的小球藻保健飲料成品呈現清亮的黃綠色,無明顯藻腥味,風味獨特,具有良好口感。

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Study on the health drink ofChlorella

PANG Ting-cai1,2,3,HU Shang-ying3,XIONG Zheng3,DENG Dong-ling1,2,3,LI Li-yan3

(1.Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conserration,Qinzhou 535099,China;2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Exploitation and Protection of Beibu Gulf Marine Biological Resources,Qinzhou 535099,China;3.Qinzhou University,Qinzhou 535099,China)

WithChlorellapowder as raw material,the algae polysaccharide was extracted by the method of ultrasonic assisted,then papain and neutral protease were used to hydrolyze alga protein. A kind of health drink was manufactured by adding right amount honey,sugar and citric acid into the filtrate. The optimal extraction condition by orthogonal test was as follows:solid-liquid ratio of 1∶15(g∶mL),pH7.0,extraction temperature of 60℃,extraction time 30min,under which condition,extraction yield ofChlorellapolysaccharide was 18.94mg/g.The optimal condition of hydrolyzing alga protein was as follows:substrate concentration of 100g/L,the amount of composite enzyme of 12000U/g,pH6.5,temperature of 55℃. Under which the degree of hydrolysis ofChlorellaprotein was up to 27.83%. The nutritional health drink was obtained with rich nutrition,unique flavor .

Chlorella;polysaccharide;protein;drinks

2014-06-11

龐庭才(1985-)，男，碩士，研究方向：海藻食品開發與研究。

廣西高校科學技術研究項目(2013YB260); 廣西高校科學技術研究項目(2013LX161)；廣西北部海洋生物多樣性養護重點實驗室、北部灣海洋生物資源開發與保護重點實驗聯合資助(2015ZC01)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)07-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.045