低氧通氣處理馬鈴薯富集γ-氨基丁酸的培養條件優化

白青云,陳遷遷,嚴煌倩,吳 佑,趙 立,畢艷紅

(淮陰工學院生命科學與化學工程學院,江蘇淮安 223003)

低氧通氣處理馬鈴薯富集γ-氨基丁酸的培養條件優化

白青云,陳遷遷,嚴煌倩,吳 佑,趙 立,畢艷紅

(淮陰工學院生命科學與化學工程學院,江蘇淮安 223003)

采用低氧通氣的方法,對馬鈴薯富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的培養工藝和培養液組分進行研究。首先通過正交實驗優化了馬鈴薯富集GABA的工藝,接著采用Box-Behnken設計對影響馬鈴薯GABA富集的培養液組分進行了優化。結果表明,低氧通氣富集馬鈴薯中GABA的最佳工藝為培養時間4h、培養溫度20℃、培養液pH5.8。極差分析表明,培養液pH是最主要的影響因素,培養溫度次之,最后是培養時間。在最適培養工藝下,馬鈴薯中GABA的富集量為0.3160mg/g,是原料中GABA含量的3.45倍;Box-Behnken設計優化的最優培養液組分為谷氨酸鈉(MSG)濃度15.43mg/mL、CaCl2濃度2.81mmol/L和VB6濃度0.03mg/mL,在此條件下馬鈴薯中GABA含量為0.5749mg/g,是原料的6.28倍,說明優化后的培養液組分能顯著提高馬鈴薯中GABA含量。方差分析表明,所建的回歸模型顯著,能很好地預測馬鈴薯中GABA含量的變化。

馬鈴薯,γ-氨基丁酸,富集,低氧通氣,培養條件

馬鈴薯(SolanumtuberosumL)是茄科茄屬一年生草本,又名土豆、山藥、洋芋、洋番薯等,營養價值十分豐富,具有多種食療保健作用[1]。我國是馬鈴薯生產大國,居世界前列。馬鈴薯塊莖是重要的糧食、蔬菜兼用作物,近二十年來,國內外對馬鈴薯的開發利用以加工馬鈴薯食品和開發馬鈴薯淀粉為主,而對馬鈴薯中蛋白質研究較少。馬鈴薯塊莖中蛋白質的含量為2.0%,若以干物質計算,則為9.8%,與小麥含量相當,高于普通玉米和稻米;其氨基酸含量和比例符合人體的需要,非蛋白氮以游離氨基酸和酞胺酸為主,塊莖所含游離氨基酸不少于20種,游離氨基酸和酞胺酸提高了塊莖的營養價值[2]。

馬鈴薯收獲后仍是一個活的有機體,在貯藏過程中不斷進行新陳代謝等生物化學變化[3]。研究表明,利用谷物及茶葉、果蔬中自身存在的谷氨酸脫羧酶,可富集對人體具有保健作用的γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)[4]。GABA是生物體內廣泛存在的一種非蛋白質氨基酸,由谷氨酸(Glu)經谷氨酸脫羧酶(GAD EC 4.1.1.15)脫羧產生,是哺乳動物大腦抑制性神經遞質。GABA具有降血壓、利尿、鎮靜神經、改善失眠以及腎肝功能活化等作用[5]。植物組織中GABA含量很低,不能滿足人體需要。報道稱,植物受到低氧、冷激、熱激、干旱、鹽脅迫和機械傷害等逆境脅迫時體內GABA含量明顯升高[6]。目前,關于食物富集GABA的方法屢見報道,如茶葉采用厭氧處理富集GABA[7]、麥胚采用水浴保溫富集GABA[8]等。低氧通氣是植物非生物脅迫的重要手段之一,其在食品加工中的使用也是安全可靠的。利用生物技術激活植物內源酶富集GABA,開發具有保健功能的食品,不但有利于提高產品的附加值,更有利于消費者健康。

本實驗選用種植面廣、糧蔬兼用的馬鈴薯為原料,采用低氧通氣方法研究馬鈴薯富集GABA的關鍵技術,優化技術參數,為開發富含GABA的馬鈴薯食品提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯 市售新鮮原料,購買后貯藏于0～4℃密封環境中,備用;GABA標品 購自美國Sigma化學品公司;其他試劑 購自國藥化學試劑有限公司,均為分析純。

TDL-40B型離心機 上海安亭儀器廠;HH-6型數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;UV-2802型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;FK-A組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市環宇科學儀器廠;SB-980型增氧泵 浙江森森實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低氧通氣富集馬鈴薯中GABA的方法 稱取20g左右的新鮮去皮馬鈴薯塊莖,置于500mL燒杯中,按料液比1∶25加入培養液(檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液),然后在培養液中通入空氣,通氣量由兩個通氣頭控制,于一定溫度下通氣處理一定時間,培養結束后取出樣品,測定其GABA含量。

1.2.2 培養工藝對馬鈴薯富集GABA的影響 對影響馬鈴薯富集GABA的培養工藝,先進行單因素實驗,設定培養溫度為20～60℃,培養時間為2～10h,緩沖液pH為4.6～6.4,在單因素實驗的基礎上,采用正交實驗設計原理的三因素三水平實驗設計,優化馬鈴薯富集GABA的最適培養工藝。實驗因素水平表見表1。

1.2.3 培養液組分對馬鈴薯富集GABA的影響 為進一步提高馬鈴薯中GABA含量,在最適培養工藝的基礎上,對影響GABA富集的外源添加物谷氨酸鈉(MSG)、維生素B6(VB6)和CaCl2的最適濃度進行研究。分別配制不同濃度的各組分溶液,所有溶液均由10mmol/L的檸檬酸緩沖液配制而成,調節初始pH至5.8,MSG濃度設為6、10、14、18mg/mL;VB6濃度設為0.01、0.02、0.03、0.04mg/mL;CaCl2濃度設為1.0、2.0、3.0、4.0mmol/L。

表1 馬鈴薯富集GABA的培養工藝因素水平表

對影響馬鈴薯GABA富集的培養液組分采用Box-Behnken design實驗設計進行優化,以GABA含量作為考察值,實驗因素水平表見表2。

表2 馬鈴薯富集GABA的培養液組分Box-Behnken實驗設計因素水平表

1.3 GABA測定方法

將富集GABA后的馬鈴薯樣品用組織搗碎機磨碎后,精確稱取1g左右樣品于20mL離心管中,加入6mL 7%的乙酸提取1h后于4000r/min離心10min,上清液中再加入4mL無水乙醇沉淀30min,4000r/min離心10min后,上清液經旋轉蒸發濃縮至干,用1mL蒸餾水溶解后于10000r/min離心10min,上清液用于測定GABA含量。GABA含量測定參照楊勝遠等[9]的方法,采用比色法測定。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 培養工藝對馬鈴薯中GABA含量的影響

2.1.1 培養溫度對馬鈴薯富集GABA的影響 由圖1可見,在20～60℃范圍內,馬鈴薯低氧通氣處理4h的條件下(培養液pH5.8),溫度對馬鈴薯中GABA含量有顯著影響,呈先上升后下降的趨勢,30℃時GABA含量與40℃無顯著差異,均最高,分別為20℃和60℃的1.15和1.48倍。發芽粟谷隨培養溫度升高GABA得到積累[10],麥胚富集GABA的最適溫度為46℃[8]。本研究中,溫度過高馬鈴薯中GABA含量下降、淀粉析出、馬鈴薯易熟化,因此,馬鈴薯中增加GABA含量的適宜培養溫度為30℃。

2.1.2 培養時間對馬鈴薯GABA含量的影響 在溫度30℃、培養液pH5.8的條件下,馬鈴薯中GABA含量隨培養時間的延長而變化的情況見圖2。從圖2可以看出,隨著培養時間的延長,馬鈴薯中GABA含量呈先急速增加而后緩慢降低的趨勢,培養8h含量最高,是培養2h的2.76倍;培養6h馬鈴薯中GABA含量與培養8h無顯著差異(p<0.05)。浸泡時間長,馬鈴薯淀粉析出,因此,選擇培養6h為馬鈴薯富集GABA的適宜時間。

圖2 培養時間對馬鈴薯中GABA含量的影響Fig.2 Effect of culture time on GABA content of potato

2.1.3 培養液pH對馬鈴薯中GABA含量的影響 在培養溫度30℃、培養時間4h的條件下,培養液pH對馬鈴薯中GABA富集的影響結果見圖3。pH在4.6～6.4之間,GABA含量隨pH的升高先升高后下降。當pH為5.2時,GABA含量最高,分別比pH4.6和6.4時含量提高41.03%和32.45%。酸性環境下有利于植物GABA的富集[11],因此,馬鈴薯富集GABA的適合pH為5.2。

圖3 培養液pH對馬鈴薯中GABA含量的影響Fig.3 Effect of culture solution pH on GABA content of potato

2.1.4 正交實驗法優化馬鈴薯富集GABA的培養條件 在單因素實驗的基礎上,以培養時間(A)、培養溫度(B)和培養液pH(C)三因素進行正交實驗,優化馬鈴薯富集GABA的最適培養工藝,實驗結果見表3。

正交實驗數據表明,馬鈴薯富集GABA的最適培養條件為A1B1C3,即培養時間4h、培養溫度20℃、培養液pH5.8。極差分析可知,培養液pH是最主要的影響因素,培養溫度次之,最后是培養時間。在最適培養工藝下,馬鈴薯中GABA含量為0.3160mg/g,是原料的3.45倍。

表3 馬鈴薯富集GABA的培養工藝正交實驗結果

2.2 外源添加物對馬鈴薯富集GABA的影響

2.2.1 MSG對馬鈴薯中GABA含量的影響 由圖4可知,隨著培養液中MSG濃度的增加,馬鈴薯中GABA含量呈先增長后下降的趨勢。當MSG濃度為14mg/mL時,GABA含量最高,比對照(最優培養工藝下)提高14.84%。MSG作為植物GAD的專一底物,可以促進GABA的合成[11]。張磊研究表明,米糠中添加MSG可以促進GABA的富集[12],本研究結果與其一致。

圖4 MSG濃度對馬鈴薯GABA含量的影響Fig.4 Effect of MSG concentration on GABA content in potato

2.2.2 CaCl2對馬鈴薯中GABA含量的影響 CaCl2對馬鈴薯中GABA富集的影響見圖5。隨著CaCl2濃度的增加,馬鈴薯GABA含量呈先增長后下降的變化趨勢。當CaCl2濃度為2.0mmol/L時,GABA富集量最大,此時GABA含量為0.3627mg/g,是對照的1.15倍。植物GAD受Ca2+的調節,增加的Ca2+刺激GAD活性,促進GABA的積累[13]。低氧脅迫下發芽粟谷中GABA含量由于Ca2+濃度的增加顯著提高[10]。

圖5 CaCl2濃度對馬鈴薯GABA含量的影響Fig.5 Effect of CaCl2 concentration on GABA content in potato

2.2.3 VB6對馬鈴薯中GABA含量的影響 培養液中添加VB6顯著促進了馬鈴薯中GABA的含量增加(圖6)。GABA含量隨VB6添加量的增加而提高,當VB6為0.03mg/mL時,GABA含量最高,是添加0.01mg/mL VB6的1.27倍。研究表明,VB6是GAD的輔基磷酸吡哆醛(PLP)的前體物質,有激活GAD達到富集GABA的作用[14]。

圖6 VB6濃度對馬鈴薯GABA含量的影響Fig.6 Effect of VB6 concentration on GABA content in potato

2.2.4 馬鈴薯富集GABA的培養液組分優化 在單因素實驗的基礎上,選用三因素三水平的Box-Behnken實驗設計對馬鈴薯富集GABA的培養液組分MSG濃度(X1)、CaCl2濃度(X2)和VB6濃度(X3)進行優化,實驗方案和相應的實驗結果見表4。

利用Design Expert軟件,對表4數據進行二次多元逐步回歸擬合,得到馬鈴薯富集GABA預測值的二次多項逐步回歸方程:

Y=-0.3173+0.0735X1+0.0405X2+13.2038X3+0.0706 X1X3+1.3975X2X3-0.0107X22-250.3750X32

表4 馬鈴薯富集GABA的培養液組分Box-Behnken實驗設計和結果

對上述回歸模型進行方差分析(表5),結果表明,回歸模型的F=19.99,p=0.0003,模型顯著,其決定系數R2=0.9625,說明此模型相關性良好,模型具有實踐指導意義。

根據回歸法分析所得二次方程,在實驗設定范圍內,分析任意兩變量之間的交互作用對響應值的影響,得到二次回歸方程的響應曲面圖,見圖7、圖8。

圖7 MSG和CaCl2的交互作用對馬鈴薯GABA含量影響的響應曲面圖Fig.7 Response plots for the interaction effects of MSG and CaCl2 on GABA content of potato

表5 回歸模型方差分析

圖8 CaCl2和VB6交互作用對馬鈴薯GABA含量影響的響應曲面圖Fig.8 Response plots for the interaction effect of CaCl2 and VB6 on GABA content of potato

當VB6濃度為0.03mg/mL時,MSG和CaCl2對馬鈴薯中GABA富集的影響見圖7。MSG的一次項和二次項對馬鈴薯GABA含量有極顯著的影響(p<0.01),CaCl2的一次項對馬鈴薯GABA含量有顯著影響,兩者的交互作用影響顯著(p<0.05)(表5)。在固定的MSG濃度下,GABA含量隨CaCl2濃度的增加呈先逐漸增加隨后緩慢下降的趨勢。當CaCl2濃度為2.81mmol/L時,GABA富集量最大。當MSG濃度為15.43mg/mL,GABA含量最高。MSG是GAD作用的底物,添加適量的MSG可以促進GABA 合成,形成有效積累[11]。Ca2+是GAD的激活劑,通過與GAD碳末端的Ca2+/CaM調節區域結合而激活其活性[13],促進GABA 富集。研究報道,MSG與CaCl2的聯合處理可促進米糠GABA含量的提高[12],本研究結果與此報道結果一致。

當MSG濃度為14mg/mL時,CaCl2和VB6濃度對馬鈴薯中GABA含量的影響見圖8。VB6的一次項和二次項對馬鈴薯GABA含量有極顯著的影響(p<0.01),兩者的交互作用對GABA含量的影響也顯著(p=0.0321)(表5)。當VB6濃度在0.02～0.03mg/mL時,GABA含量呈上升趨勢,超過0.03mg/mL,GABA含量下降。研究表明,一定濃度的VB6處理促進了米糠[12]、米胚[15]和豇豆[16]中GABA的積累量。本研究發現,VB6處理有利提高馬鈴薯中GABA含量。

根據Box-Behnken實驗結果,馬鈴薯富集GABA的最佳培養液組分濃度分別為MSG濃度15.43mg/mL、CaCl2濃度2.81mmol/L和VB6濃度0.03mg/mL,在此條件下馬鈴薯富集GABA的預測值為0.6014mg/g,驗證實驗得出實測值為0.5749mg/g,說明預測值和實際值之間存在較高的擬合度,所建立的模型是可靠的,可以用來描述組分濃度與響應值之間的關系。以最適濃度培養液培養的馬鈴薯GABA含量是對照(未添加各組分,0.3160mg/g)的1.81倍,是原料(0.0916mg/g)的6.28倍,說明優化后的培養液能顯著提高馬鈴薯中GABA含量。

3 結論

采用正交實驗設計優化了馬鈴薯富集GABA的培養工藝,結果表明,培養液pH、培養溫度和培養時間對馬鈴薯GABA富集有顯著影響,三因素的影響順序依次為培養液pH>培養溫度>培養時間,最佳的培養工藝為培養時間4h,培養溫度20℃,培養液pH5.8,此時馬鈴薯中GABA的富集量為0.3160mg/g,是原料的3.45倍。采用響應面的Box-Benhnken法對馬鈴薯富集GABA的培養液組分濃度進行優化,馬鈴薯GABA富集的最佳培養液組分是MSG濃度15.43mg/mL、CaCl2濃度2.81mmol/L和VB6濃度0.03mg/mL,在此條件下馬鈴薯中GABA含量為0.5749mg/g,是原料的6.28倍。方差分析可知,CaCl2、MSG、VB6濃度對馬鈴薯中GABA的富集均有顯著影響,MSG和CaCl2、CaCl2和VB6的交互作用均對馬鈴薯中GABA富集有顯著影響。

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Optimization of culture conditions for γ-aminobutyric acid accumulation in potato using hypoxia aerating

BAI Qing-yun,CHEN Qian-qian,YAN Huang-qian,WU You,ZHAO Li,BI Yan-hong

(School of Life Science and Chemical Engineering,Huaiyin Institute of Technology,Huai’an 223003,China)

The culture processes and culture solution components of γ-aminobutyric acid(GABA)accumulation in potato using hypoxia aerating method were researched in this paper. Firstly,the culture processes of GABA accumulation in potato was optimized using orthogonal experimental design. Subsequently,the optimal culture solution components on GABA accumulation of potato were investigated using Box-Behnken design. The results showed that the optimum culture processes of GABA accumulation in potato under hypoxia aerating were culture time 4h,temperature 20℃,and pH of culture solutions 5.8. Range analysis indicated that pH of culture solutions was the most important influence factor,followed by culture temperature,and culture time was the last. Under these conditions,the accumulation of GABA in potato was 0.3160mg/g,which was 3.45 times of material. Box-Behnken experimental design results displayed the optimum compositions of culture solution were MSG concentration 15.43mg/mL,CaCl2concentration 2.81mmol/L,and VB6concentration 0.03mg/mL. Under these conditions,the highest GABA content of potato was 0.5749mg/g,6.28-fold of material. It indicated that the optimized culture solution compositions significantly increased GABA content of potato. Analysis of variance indicated that the regression model was significant,could forecast the changes of GABA accumulation in potato excellently.

potato;γ-aminobutyric acid;accumulation;hypoxia aerating;culture conditions

2014-08-05

白青云(1973-),女,博士,副教授,研究方向:農產品加工與貯藏。

江蘇省高等學校大學生實踐創新訓練計劃項目(2013)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)07-0241-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.043