大孔樹脂純化鹽酸育亨賓的工藝研究

雷智東,孫華庚,趙艷敏,郭曉玲,劉岱琳,*

(1.中國人民武裝警察部隊后勤學院,天津 300162;2.廣東藥學院,廣東廣州 510006;3.天津尖峰天然產物研究開發有限公司,天津 300457)

大孔樹脂純化鹽酸育亨賓的工藝研究

雷智東1,2,孫華庚3,趙艷敏1,郭曉玲2,劉岱琳1,*

(1.中國人民武裝警察部隊后勤學院,天津 300162;2.廣東藥學院,廣東廣州 510006;3.天津尖峰天然產物研究開發有限公司,天津 300457)

研究大孔樹脂對鹽酸育亨賓的純化條件。以靜態飽和吸附量和解吸率為指標,比較了八種不同類型的大孔樹脂對鹽酸育亨賓的純化效果。結果表明,D101樹脂對鹽酸育亨賓的純化效果較好,對D101樹脂的純化條件進行了靜態實驗和動態實驗。經實驗確定最佳純化條件為上樣濃度:1.0mg/mL,樣液pH2～3,上樣流速為4.0mL/min,樹脂對樣品的吸附量38.2mg/g,洗脫劑為50%乙醇,洗脫體積6BV。經D101大孔樹脂純化后,鹽酸育亨賓的純度相對于提取粗品提高4～5倍。

鹽酸育亨賓,大孔樹脂,吸附,解吸

鹽酸育亨賓是一種α-腎上腺素受體拮抗劑,通過選擇性的阻斷突觸前α-腎上腺素能,令血管平滑肌擴張,增加外周副交感神經的張力,降低交感神經張力[1],有著廣泛的藥理作用。有報道,用于臨床治療動脈硬化,還可用于保護內毒素引起的急性肺損傷的α2腎上腺素能受體[2],目前最主要的應用于男性性功能障礙[3-4],多用于男性保健品原料。現在市場上天然植物來源的育亨賓提取物含量較低。劉璇[5]等用大孔樹脂對云南蘿芙木中的育亨賓進行分離純化,由于蘿芙木中的鹽酸育亨賓含量非常低,盡管通過大孔樹脂進行純化,但其純度僅達到5.9%。李鵬[6]等用離子交換樹脂對育亨賓總生物堿進行了分離純化,用氨水加80%乙醇溶液洗脫,該精制過程生產成本較高。本文首次利用來源非洲塞拉利昂的育亨賓樹的干燥樹皮為原料利用酸水提取。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

育亨賓藥材購自非洲塞拉利昂,經沈陽藥科大學孫啟時教授鑒定為非洲植物育亨賓Corynante Yohimbe的干燥樹皮,該標本保存在武警后勤學院生藥學與藥劑學教研室,編號YLDL-2009061;鹽酸育亨賓對照品 成都曼斯特生物科技有限公司,批號MUST-13021005,純度≥98%;甲醇和乙腈(色譜純)、95%乙醇 天津市康科德科技有限公司;水為超純水,ADS-7、ADS-8、806大孔樹脂 天津南開合成科技有限公司;D101、D293、D301、D315大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司;HP20大孔樹脂 日本三菱。

日本島津公司LC-20AT型高效液相色譜儀(自配SPD-M20A型紫外檢測器、CTO-20柱溫箱);cosmosil C18柱(2.5μm,4.6mm×250mm);EYEL4型旋轉蒸發儀 上海愛朗公司;NewClassicMS105DU半微量天平 梅特勒-托利多;FA1204B電子天平 上海精密科學儀器有限公司;MYB型調溫電熱套 天津市中環實驗電爐有限公司;FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽酸育亨賓粗提液的制備 參照文獻[7],稱取粉碎后的育亨賓藥材150g,加入3000mL 0.5%鹽酸水溶液,在圓底燒瓶中回流提取,溶劑沸騰后計時3h。過濾保留濾液,減壓蒸餾至2000mL,得到以鹽酸育亨賓為標量的1.0mg/mL溶液。

1.2.2 鹽酸育亨賓高效液相色譜含量測定方法及工作曲線的制作 色譜柱:Cosmosil C18柱(4.6mm×250mm,2.5μm);流動相,甲醇∶乙腈∶水∶磷酸(60∶1∶90∶0.4);檢測波長:226nm;流速為1.0mL/min;柱溫為30℃,進樣量10μL,測定鹽酸育亨賓峰面積,繪制標準曲線。

精密稱取鹽酸育亨賓1.11mg,加1mL甲醇溶解定容至10mL,搖勻,得0.111mg/mL作為鹽酸育亨賓標準品溶液,分別量取鹽酸育亨賓標準品溶液,用甲醇稀釋配制成0.555、1.11、1.39、1.67、2.22μg/mL的溶液。按上述色譜條件各進樣10μL,記錄與其對應的峰面積,將樣品濃度(X)與經高效液相色譜測定的峰面積(Y)進行線性回歸。

1.2.3 大孔樹脂預處理 將806、D101、D293、D301、D315、HP20、ADS-7、ADS-8等,八種樹脂分別用95%乙醇充分溶脹浸泡24h。用蒸餾水沖洗,至無明顯乙醇味為止。用5% NaOH浸泡4h,用蒸餾水沖洗至中性,再用0.5%鹽酸水溶液浸泡4h,用蒸餾水沖洗至中性。

1.2.4 最佳樹脂篩選

1.2.4.1 靜態吸附實驗 準確稱取預處理過的樹脂1.00g于250mL錐形瓶中,加入定量的吸附原液,避光密閉,置于振蕩器中,25℃,100r/min震蕩,定時從上清液中取樣,測定育亨賓的量[8-10]。根據以下公式計算吸附量:

吸附量(mg/g)=(C0-C1)·V1/M

式中:C0、C1-吸附前、后原吸附液中鹽酸育亨賓濃度,mg/mL;V1-原吸附液體積,mL,M-樹脂重量,g。

1.2.4.2 靜態解吸實驗 將充分吸附的樹脂過濾,用水沖洗后濾干,置于250mL錐形瓶中,加入30%的乙醇水溶液150mL,置于密閉的振蕩器中,25℃,100r/min震蕩,定時從上清液中取樣,測定鹽酸育亨賓的量。根據以下公式計算吸附量:

解吸率(%)=CV2×150/W

式中：C-洗脫液中鹽酸育亨賓的濃度,mg/mL;W-吸附總量,mg;V2-洗脫總體積,mL。

分別稱取1.00g處理好的806、D101、D301、D315、D293、ADS-7、ADS-8、HP20樹脂于250mL錐形瓶中,按上述方法,使其充分吸附飽和,檢測其吸附量,計算吸附率,并用30%乙醇溶液解吸,計算其解吸率。

1.2.5 D101樹脂靜態實驗

1.2.5.1 料液濃度對樹脂吸附量的影響 準確稱取處理好的D101樹脂1.00g,置于250mL錐形瓶中,分別加入濃度為0.5、1.0、2.0、2.5、3.0mg/mL的鹽酸育亨賓溶液120、60、30、24、20mL,進行靜態吸附實驗。

1.2.5.2 不同洗脫溶劑對解吸的影響 為提高鹽酸育亨賓的回收率,通常都選用解吸率較高的溶劑作為解吸溶劑,但考慮到鹽酸育亨賓應用在醫藥行業中,因此,本實驗只考慮選擇不同濃度的乙醇作為洗脫劑[11]。

考察不同濃度乙醇溶液對解吸的影響。分別稱取處理好的樹脂1.00g共6份,置于錐形瓶中,加入等量的原吸附液,使其充分吸附后,將樹脂過濾,分別加入相同體積的10%乙醇水溶液、20%乙醇水溶液、30%乙醇水溶液、40%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、60%水乙醇溶液,使其充分解吸,測定其結果。

1.2.6 D101樹脂動態實驗

1.2.6.1 流速吸附的影響 樹脂裝量30g,樣品動態吸附時的流速分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL/min,測定室溫下,流速對D101樹脂的動態吸附影響。

1.2.6.2 樣品最大吸附量的確定 精密量取處理好的濕樹脂250mL裝柱,以流速為4mL/min上樣,考察上樣體積對吸附量的影響。

1.2.6.3 洗脫體積對解吸的影響 吸附飽和的D101樹脂,用少量水洗去吸附的水溶性雜質類,再用50%的乙醇洗脫,洗脫速度為4mL/min,測定室溫下50%乙醇水溶液對樹脂吸附的鹽酸育亨賓的動態洗脫效果,確定洗脫曲線。

2 結果與分析

2.1 鹽酸育亨賓標準曲線的制備

由圖1可知,鹽酸育亨賓標準曲線為Y=3528509X-35903(R2=0.9997),結果表明,鹽酸育亨賓在0.555～2.22μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

圖1 標準曲線Fig.1 The standard curve

2.2 樹脂篩選

結果如表1所示。

表1 不同樹脂的吸附率與解吸率

結果顯示,各樹脂的靜態吸附率差異顯著,吸附順序依次是D101>ADS-8>HP20>D315>D301>ADS-7>806>D293;各樹脂的靜態解吸率率差異顯著,解吸順序依次是HP20>D101>ADS-8>ADS-7>D315>D293>D301>806,此現象說明,大孔樹脂對鹽酸育亨賓吸附解吸有較強的選擇性,其吸附解吸性能的大小與樹脂的類型有較大關系。

綜合樹脂對鹽酸育亨賓的吸附與解吸,表明八種大孔樹脂中D101、ADS-8兩種樹脂對鹽酸育亨賓有較強的吸附能力,HP20、D101、ADS-8、ADS-7這四種樹脂對鹽酸育亨賓有著較強的解吸能力。無論是吸附還是解吸,D101樹脂都優于其他樹脂,因此,綜合考慮本實驗選用D101樹脂對鹽酸育亨賓進行精制純化。

2.3 D101樹脂的靜態吸附解吸研究

2.3.1 料液濃度對樹脂吸附量的影響 結果如圖2,在鹽酸育亨賓濃度較低,樹脂吸附鹽酸育亨賓的能力隨著濃度的增加而增加,當料液濃度提高超過1mg/mL時,吸附量隨濃度增加反而減少。這可能與接觸面積有關,但超過一定濃度其雜質也影響樹脂表面與鹽酸育亨賓的接觸機會,因此,本實驗的樣品液濃度控制在1mg/mL。

圖2 不同濃度的樣品溶液對吸附的影響Fig.2 Effects of different concentration of sample solution on absorption

本實驗考察上樣濃度時,如果溶液濃度過大,會有沉淀出現,此會影響樹脂對溶液的吸附,因此,濃度應較低些,有利于樹脂吸附。

2.3.2 不同洗脫溶劑對解吸的影響 結果如圖3,不同濃度乙醇溶液的解吸率,隨著乙醇濃度的增加,解吸率先升高后下降,當乙醇濃度達到50%,解吸率達到92.8%,因此,本實驗選用50%乙醇水溶液作為洗脫劑。

圖3 不同濃度乙醇溶液的D101樹脂靜態解吸曲線Fig.3 Static desorption curve of D101 resin at different ethanol solution

在選擇洗脫溶劑時,選取50%乙醇水溶液,可能是當乙醇濃度過大時,在洗脫鹽酸育亨賓的同時將大量的雜質一同洗脫,從而導致結果降低。

2.4 D101樹脂的動態吸附解吸研究

2.4.1 流速吸附的影響 結果如圖4,上料液流速對吸附率的影響差異不大,當流速為4mL/min時,吸附率相對較高,達到87.9%。此外流速過慢消耗時間太多,延長生產周期,流速過快吸附較差,且易流失。因此,綜合考慮選擇流速為4mL/min較為適宜。

圖4 流速對吸附的影響Fig.4 Effects of velocity of flow on adsorption

流速的控制也是本實驗中較為關鍵的步驟,流速較慢效果較好,但同時考慮到周期,因此綜合結果,選擇出最佳流速,如果速度過快,會提前泄漏鹽酸育亨賓,導致樣品損失。

2.4.2 樣品最大吸附量的確定 結果如圖5,當上樣體積為1800mL,達到吸附飽和,流出液與原液中鹽酸育亨賓量達到相近,這時吸附率達到92.5%,此時為D101樹脂對鹽酸育亨賓純品的最大吸附量44.74mg/g,如果選擇最大吸附量時作為上樣體積,則會有大量的鹽酸育亨賓泄漏,造成資源浪費;當上樣體積為1100～1200mL時,剛剛開始有泄漏,考慮到整體純化效率、節約生產成本,確定250mL樹脂的最佳上樣體積為1200mL。因此我們選擇在達到泄漏點時的吸附量作為上樣體積,即樹脂的吸附量為38.2mg/g,上樣體積為1200mL。吸附過程中鹽酸育亨賓漏出的時間較晚,開始泄漏時,泄漏迅速,說明D101樹脂的吸附并不是緩慢型,在考察靜態吸附和解吸時也同樣表現出這樣的結果,飽和前不易漏出,吸附較好。

圖5 動態吸附曲線Fig.5 Dynamic adsorption curve

2.4.3 洗脫體積對解吸的影響 結果如圖6,在前1000mL(4BV)時,鹽酸育亨賓解吸率達到91.6%,前250mL解吸液中就有大量的鹽酸育亨賓流出,因此,從一開始就要收集解吸液。D101樹脂上吸附的鹽酸育亨賓,易被解吸,只用很少量的洗脫劑即可使樹脂柱上吸附的鹽酸育亨賓解吸下來,在解吸到1500mL(6BV)時,洗脫解吸率能達96.5%,解吸較完全。最終測定經D101大孔樹脂精制純化后的鹽酸育亨賓含量高達17%。

圖6 動態解吸曲線Fig.6 Dynamic desorption curve

3 結論與討論

在所選的8種大孔樹脂中,D101樹脂對鹽酸育亨賓有較好的吸附和解吸能力,可用于鹽酸育亨賓的純化。通過D101樹脂靜態實驗和動態實驗,確定了最佳純化條件:上樣濃度為1mg/mL,上樣流速為4mL/min,鹽酸育亨賓上樣量38.2mg/g,洗脫劑為50%乙醇水溶液,洗脫體積6BV。通過該條件的純化,可將提取的粗品鹽酸育亨賓提取物純度從3.7%提高到17%以上,提高4～5倍。

本實驗的吸附原液是用0.5%鹽酸水溶液提取,吸附原液的pH為2～3,當調節pH為4以上,就會出現分層或沉淀,故本實驗不考察pH對樹脂吸附的影響,直接將原吸附液pH為2～3進行吸附,并且在此條件下育亨賓處于鹽酸育亨賓,極性變大,更容易吸附在樹脂上。

本研究利用D101大孔樹脂,對育亨賓樹皮粗提液進行精制純化,其工藝過程簡單,并且所用洗脫溶劑僅為乙醇水溶液,安全環保。工藝中D101樹脂,乙醇均可重復利用,不僅節約能源并且降低成本。通過最優純化工藝,將鹽酸育亨賓的純度提高,效果明顯,具有很高的應用價值。本實驗為生產較高純度的鹽酸育亨賓提供參考。

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Purification of Yohimbine Hgydrochloride by macroprous resin

LEI Zhi-dong1,2,SUN Hua-geng3,ZHAO Yan-min1,GUO Xiao-ling2,LIU Dai-lin1，*

(1.Logistics College of Chinese People’s Armed Police Forces,Tianjin 300162,China;2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;3.Tianjin Jianfeng Natural Product R&D Co.,Ltd.,Tianjin 300457,China)

The purification of yohimbine hydrochloride with macroporous resin was studied. The static adsorption and desorption performance of 8 kinds of resins for yohimbine hydrochloride were compared with static adsorption capacity and elution ratio as evaluation factors. The results showed that the optimum conditions of the static and dynamic adsorption and desorption for separating yohimbine hydrochloride by D101 resin were studied.The optimal conditions were:the concentration of the sample solution of 1.0mg/mL,pH2～3,the colume of the sample quantity of 38.2mg/g,best velocity 4.0mL/min,eluting with 50% ethanol,eluting 6BV. The yohimbine hydrochloride with respect to the purity improved 4～5 times.

Yohimbine hydrochloride;macroporous resin;adsorption;desorption

2014-07-24

雷智東(1989- )，男，碩士研究生，研究方向：天然產物活性成分研究。

天津市科技特派員項目(14JCTPJC00469)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)07-0237-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.042

*通訊作者:劉岱琳(1973- )，女，博士，教授，研究方向：天然產物活性成分研究。