酶解扁杏仁粕制備抗氧化肽工藝

趙換霞,張海生,楊淑芳

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710062)

酶解扁杏仁粕制備抗氧化肽工藝

趙換霞,張海生*,楊淑芳

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710062)

為優化酶解扁杏仁粕制備抗氧化肽的工藝條件,采用響應面分析法,研究了加酶、底物濃度、溫度和pH對酶解扁杏仁粕的影響。以還原力為響應值,優化參數加酶量6725U/g,底物濃度3%、溫度60℃和pH8.28。酶解液的還原力為0.743,與模型預測具有較好的擬合性。此工藝制備的扁杏仁抗氧化肽具有較強的體外抗氧化性,且其含有較高的抗氧化氨基酸。

杏仁粕,抗氧化肽,氨基酸

大扁杏仁是一種甜杏仁,富含蛋白質、脂肪、維生素、礦物質和膳食纖維,營養價值極高,其中蛋白質含量約26%左右[1-2],是一種具有很高經濟利用價值的植物蛋白[3]。營養學研究發現,蛋白質經消化道酶作用后并不是完全以游離氨基酸的形式被吸收,而是主要以肽的形式被吸收[4]。生物活性肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質,是具有氨基酸序列的多肽,并在腸道消化過程中充當新陳代謝潛在生理效應物[5]。近年來大量研究表明,蛋白質經合適的蛋白酶水解制成的多肽產品具有一定的抗氧化活性[6],國內外學者已從多種食物蛋白酶解液中分離出具有抗氧化活性的肽片段,包括大豆抗氧化肽[7-8]、花生抗氧化肽[9]、玉米抗氧化肽[10-11]。黃昆[12]以風味蛋白酶酶解脫脂山杏仁,制備了對DPPH·清除能力較強的杏仁抗氧化肽。而人類許多慢性疾病及衰老現象均和人體內的自由基水平失衡有關,過量的自由基對機體產生氧化性損傷,當這種損傷不能及時修復并且積累到一定程度會導致心腦血管疾病、糖尿病、高血壓等疾病的發生[13-15],因此,對于抗氧化肽的開發具有重要意義。目前,對于大扁杏仁的研究主要集中在對杏仁油的研究,而榨油后蛋白質含量高達40%以上的杏仁粕,被用作動物飼料或者制作飲料,其利用價值低。

本實驗就堿性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶解扁杏仁粕制備抗氧化活性肽的最佳酶解條件進行了研究,并對所制得的扁杏仁抗氧化肽進行了全面的體外抗氧化評價,同時對扁杏仁抗氧化肽中的氨基酸進行了評價,從而為開發具有高附加值的扁杏仁抗氧化活性肽提供理論基礎和實驗依據,也有利于扁杏仁粕的資源深度開發利用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

扁杏仁陜西省榆林市榆陽區旺達扁杏仁加工廠提供；堿性蛋白酶BRITISH DRUG HOUSE公司(BDH);風味蛋白酶、BDH、DPPH Sigma公司；鐵氰化鉀天津盛奧、TCA天津天力、磷酸氫二鈉天津天力、磷酸二氫鈉天津天力、氯化鐵天津盛奧、硫酸亞鐵天津盛奧、水楊酸天津恒興、無水乙醇天津富宇、雙氧水天津富宇,抗壞血酸等都為分析純,實驗用水為去離子蒸餾水。

HH-S4A型電熱恒溫震蕩水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司;AL204型電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司;LGJ-10C型冷凍干燥機北京四環科學儀器廠有限公司;PHSJ-3F型實驗室pH計上海儀電科學儀器股份有限公司;低速臺式大容量離心機上海安亭科學儀器廠;L3可見分光光度計:上海儀電分析儀器有限公司;氨基酸自動分析儀:日本HITACHI公司。

1.2實驗方法

1.2.1扁杏仁短肽的制備將扁杏仁粉碎,在室溫下用石油醚(沸程30～60℃)脫脂3次,置通風櫥中24h以揮發有機溶劑,得脫脂扁杏仁粉,過60目篩。取脫脂扁杏仁粉若干,按比例加入蒸餾水,放入恒溫震蕩水浴鍋中,待溫度恒定后,調至適當的pH,按一定的酶底物比加入堿性蛋白酶和風味蛋白酶開始水解,水解一定時間后,終止反應,沸水浴滅酶15min。冷卻后以4000r/min離心20min,取上清液過濾即得酶解液。

1.2.2扁杏仁抗氧化肽制備的響應面優化實驗以固定酶解時間為2.5h,堿性蛋白酶和風味蛋白酶的酶活比為3∶2;基于單因素實驗結果,以酶用量、底物濃度、溫度和pH為自變量,以還原力為響應值,根據BOX-Benhnken設計原理,設計4因素3水平的響應面分析實驗,實驗因素水平及編碼見表1。

表1　響應面實驗因素水平

式中:A0為空白對照溶液的吸光度;A1為加入樣品液后的吸光度;A2為不加水楊酸溶液酶解液的吸光值。

1.2.4還原力的測定將2mL的扁杏仁粕酶解液與2mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)和2mL 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻后在50℃反應20min,然后加入2mL 10%的TCA溶液,3000r/min離心10min。吸取2mL上清液于試管中,并加入2mL蒸餾水和0.4mL 0.1% FeCl3溶液,反應10min后在700nm處測定其吸光度[17]。吸光度值越大則樣品的還原能力越強。

1.2.5DPPH自由基清除率的測定取2mL不同濃度的樣品溶液于10mL試管中,加入2mL 0.1mmol/L DPPH無水乙醇溶液,混合均勻,于室溫下避光反應30min后,在517nm測定其吸光度[18]。每個樣品3組重復。

式中:Ai為DPPH溶液+樣品溶液的吸光度;Ai0為無水乙醇+樣品溶液的吸光度;A0為DPPH溶液+去離子水的吸光度。

1.2.6酶解產物氨基酸組成的分析稱取0.05g冷凍干燥后的杏仁粕酶解物,用6mol/L鹽酸于110℃水解24h,脫酸后,用水定容至5mL,氨基酸自動分析儀測定[19]。

1.3數據分析及處理

響應面實驗設計與分析采用Design-expert(7.0)軟件,實驗數據采用Excel和SPSS數學分析軟件進行分析及處理。

2　結果與討論

2.1響應面設計結果分析

2.1.1模型的建立與顯著性分析表2為響應面分析設計及實驗結果。對表2結果進行二次多項式回歸擬合,獲得響應值(Y)與酶用量(X1)、底物濃度(X2)、溫度(X3)和pH(X4)的二次回歸方程,如下:

Y=+0.75+0.012X1+0.026X2+6.667×10-3X3+0.046X4+0.012X1X2-0.027X1X3-0.074X1X4+0.015X2X3-0.047X2X4-0.011X3X4-0.053X12-0.076X22-0.041X32-0.061X42

2.1.2響應面分析圖1為根據多元回歸模型做出的響應面圖。由圖1結合表3中各因素的p值可以看出,模型的一次項X4,交互項X1X4,二次項X12、X22、X32和X42對還原力的影響達到極顯著水平(p<0.0001),一次項X2,交互項X2X4對還原力的影響達到了高度顯著性水平(p<0.01);一次項X1,交互項X1X3對還原力的影響達到顯著水平(p<0.05)。表明實驗因素對響應值不是簡單的線性關系,二次項和交互項對響應值也有很大的影響。比較響應面模型二次多項式方程中一次項的方差的大小,可以判斷影響因素的主次順序。各因素對還原力影響程度大小為X4>X2>X1>X3,即pH>底物濃度>加酶量>溫度。

表2　響應面分析設計及實驗結果

表3　還原力的方差分析表

2.1.3最優工藝條件的確定及驗證對實驗模型進行典型性分析,通過響應面軟件分析,獲得堿性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶解扁杏仁粕制備杏仁抗氧化肽的最優條件為:酶用量6725.65U/g、底物濃度2.98%、溫度60.54℃、pH8.28,還原能力理論值為0.759;為檢驗響應面方法的可行性,并綜合考慮實際操作的便利性,將工藝參數修正為:酶用量6725U/g、底物濃度3%、溫度60℃、pH8.28,經3次平行實驗驗證,得到還原力的平均值為0.743,與理論值相差2.22%。說明該模型與實際情況擬合較好,驗證了所預測模型的正確性。因此,響應面法對堿性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶解制備扁杏仁抗氧化肽工藝的條件的參數優化是可行的,得到的工藝條件具有實際應用價值。

2.2扁杏仁抗氧化肽體外活性測定

利用響應面軟件分析得到最優酶解條件,制備扁杏仁抗氧化肽酶解液,將其冷凍干燥后,測定其對羥基自由基的清除率、DPPH·的清除率以及還原能力,并與同濃度的VC的抗氧化能力進行比較,結果如圖2～圖4所示。

圖1　還原力的響應面Fig.1　Response surface plots for reducing power

圖2　不同質量濃度扁杏仁抗氧化肽對羥基自由基的清除能力Fig.2　The hydroxyl radical scavenging potential of apricot kernel anti-oxidation activity polypeptides at various concentrations

圖3　不同質量濃度扁杏仁抗氧化肽的還原力Fig.3　The reducing power of apricot kernel anti-oxidation activity polypeptides at various concentrations

圖4　不同質量濃度扁杏仁抗氧化肽對DPPH自由基的清除能力Fig.4　The DPPH free radical scavenging potential of apricot kernel anti-oxidation activity polypeptides at various concentrations

羥自由基是毒性最強的一種自由基,它會和機體細胞的糖、蛋白質、脂質和核苷酸等生物大分子發生氧化反應,從而對細胞和機體造成損傷[21-22]。由圖2可以看出,隨著扁杏仁抗氧化肽濃度的增加,羥基自由基的清除能力也隨之增加,當濃度達到12mg/mL時,羥基自由基的清除率達到82.27%,接近于同濃度VC的能力,是同濃度VC能力的90.64%;抗氧化劑的總還原力與其抗氧化性之間存在聯系,總還原力越強,抗氧化能力就越強[23],由圖3可以看出,扁杏仁抗氧化肽的還原能力隨著酶解產物濃度的增加而升高,酶解產物的濃度在12mg/mL的濃度下,其還原能力的吸光度值為1.36,是同濃度VC能力的95.67%。由圖4可以看出,DPPH·的清除率同樣隨酶解產物濃度的升高而升高,在較低濃度下也具有良好的清除能力,當扁杏仁抗氧化肽的濃度為6mg/mL時,其清除率為57.58%。

2.3酶解產物氨基酸組成分析

由表4可知,杏仁抗氧化肽含有15種氨基酸,LiB等人在文獻[24]中報道:蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸是四種有自由基清除效果的關鍵氨基酸。也有研究指出[25],半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸,苯丙氨酸以及它們的衍生物具有抗氧化性。由表4可知,在扁杏仁抗氧化肽中,所有這些具有抗氧化活性的氨基酸占氨基酸總量的50.77%。此外,總疏水基氨基酸的含量高達39.45%,而具有抗氧化活性物質多與堿性氨基酸和疏水性氨基酸有關[26];同時,肽的抗氧化活性強弱與其氨基酸組成及序列等化學結構和分子量大小密切相關[27]。扁杏仁肽中具有抗氧化活性的氨基酸含量較高,這可能是扁杏仁肽具有抗氧化作用的原因之一。因此,氨基酸的組成表明利用此生產工藝制備扁杏仁肽具有良好的抗氧化能力。

表4　扁杏仁抗氧化肽中氨基酸的含量

注:*為疏水性氨基酸;n.d 表示沒有測定。

3　結論

在單因素實驗的基礎上,采用響應面分析法優化得出扁杏仁抗氧化肽的最佳酶解工藝為:酶用量6725U/g、底物濃度3%、溫度60℃、pH8.28,在該條件下制備的扁杏仁抗氧化活性的還原力為0.743。對扁杏仁抗氧化肽的羥基自由基的清除率、DPPH·的清除能力和還原力進行了全面的研究,并對其氨基酸組分進行了分析,結果顯示,扁杏仁抗氧化肽具有較強的清除自由基的能力和還原能力,其抗氧化氨基酸含量較高,可能是一種具有潛在應用價值的抗氧化劑。

[1]中國醫學科學院衛生研究所編著.食物成分表[M].北京:人民衛生出版社,1980.

[2]李新華,閆榮.遼西大扁杏杏仁蛋白的組成及堿法提取工藝的研究[J].食品科技,2009,34(5):132-135.

[3]宋曰欽,王建中,趙云霞,等.苦杏仁蛋白開發利用的前景[J].食品科學,2006,22(1):68-70.

[4]孫偉峰,周素梅,王強.酵母蛋白肽酶解制備工藝研究[J].食品工業科技,2009,5:29-32.

[5]單春喬,趙紅巖,崔麗,等.生物活性肽生理作用及功能研究[J].糧食與油脂,2011(4):15-17.

[6]Mine Y,Shah ID I F.Nutraceutial proteins and peptides in health and disease[M].New York:CRC Press:2006.

[7]Chen Huamin,Koji Muramoto,Fumio Yamauchi.Structural analysis of anti-oxidative peptides from soybean β-conglycinin[J].Agric Food Chem,1995,43:574-578.

[8]Chen HM,Muramoto K,Yamau chi F,et al.Antioxidative Properties of histidine containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein[J].J Agric Food Chem,1998,46:49-53.

[9]于麗娜,孫杰,劉少芳,等.花生抗氧化水解產物制備及其抗氧化活性研究[J].核農學報,2013,27(2):188-196.

[10]刁靜靜,曹龍奎.大孔吸附樹脂吸附分離高活性玉米抗氧化肽[J].食品科學,2011,32(16):187-191.

[11]李秀霞,韓魯佳.玉米抗氧化肽的制備及純化[J].食品與發酵工業，2010,36(7):73-77.

[12]黃昆,顧欣,王文江,等.山杏仁多肽的制備及清除自由基能力研究[J].食品工業科技,2012,33(18):107-115.

[13]Valko Marian,Leibfritz Dieter,Moncol Jan,et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2007,39(1):44-84.

[14]Xu Li,Li Hongmei,Huang Yi bing,et al.A study on anti-oxidative activity of soybean with Lino Leic acid peroxidation systems[M].Chem Res Chinese,2006,22(2):205-208.

[15]Sachidanandame K,Fagan S C,Ergul A.Oxidative stress and cardiovascular disease:antioxidants and unresolved issues[J]. Cardiovasc Drug Rev,2005,23:115-132.

[16]王曉坤.超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的研究[D].河南:河南工業大學,2012.

[17]王書云.玉米肽的精制及其抗氧化活性的研究[D].武漢:武漢工業學院,2010.

[18]Jamdar SN,Rajalakshmi V,Pednekar MD,et al.Influence of degree of hydrolysis on functional properties,antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate[J].Food Chemistry,2010,121(1):178-184.

[19]Yan Mingyan,Li Bafang,Zhao Xue,et al.Characterization of acid-soluble collagen from the skin of walleye Pollock(Theragra chalcogramma)[J].Food Chem,2008,107(4):1581-1586.

[20]董周永,徐兆剛,周亞軍,等.Protamex酶解馬鈴薯蛋白粉制備抗氧化肽工藝優化[J].農業工程,2013,3(6):75-78.

[21]Rollet-Labelle E,Grange MJ,Elbim C,et al.Hydroxyl radical as a potential intracellular mediator of polymor-phonuclear neutrophil apoptosis[J].Free Radical Biology and Medicine,1998,24:563-572.

[22]Stohs S J,Bagchi D.Oxidative mechanism in the toxicity of metal ions[J].Free Radical Biology and Medicine,995,18:321-336.

[23]綦蕾,王振宇.紅松松仁抗氧化肽的制備及體外抗氧化活性評價[J].食品與發酵工業,2010,36(7):78-82.

[24]Li B,Chen F,Wang X,et al.Isolation and identification of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization-massspectrometry[J].Food Chem,2007,102:1135-1143.

[25]Pena-Ramos EA,Xiong YL.Antioxidant activity of soy protein hydrolysates in a lipodomal system[J].J. Food Sci,2002,67(8):2952-2956.

[26]代卉,施用暉,韓芳,等.小麥肽免疫活性及抗氧化作用的研究[J].天然產物研究與開發,2009,21:473-476.

[27]Chen H M,Muramoto K,Yamauchi F,et al.Antioxidant activity of designed peptides basedon the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein[J].J Agric Food Chem,1996,44(9):2619-2623.

Technology for production of antioxidant peptides from apricot kernel meal by enzymolysis

ZHAO Huan-xia,ZHANG Hai-sheng*,YANG Shu-fang

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shannxi Normal University,Xi’an 710062,China)

In order to optimize enzymolysis conditions for production of antioxidant peptides from apricot kernel meal,the effect of operating conditions,such as enzyme dosage,substrate concentration,temperature and pH value,were analyzed by response surface methodology. Reducing power was chosen as the response value and optimum conditions were as follows:enzyme dosage 6725U/g,substrate concentration 3%,temperature 60℃ and pH8.28. Under such conditions,reducing power of enzymatic hydrolysates was 0.743,which was well matched with the predicted yield. Apricot kernel meal antioxidant peptide prepared with these enzymatic hydrolysis technological parameters presented strong antioxidant activity and it contained higher antioxidant amino acids.

apricot kernel meal;antioxidant peptide;amino acids

2014-07-10

趙換霞(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：農產品加工及功能食品。

科技部農業科技成果轉化資金項目(2011CB236000017)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)07-0232-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.041

*通訊作者:張海生(1965-)，博士，副教授，研究方向：動植物資源開發利用及功能食品研究。