發酵馬鈴薯蛋白制備抗氧化肽

高丹丹,孫青青,郭鵬輝,陳士恩，歐陽霞輝

(西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030)

發酵馬鈴薯蛋白制備抗氧化肽

高丹丹,孫青青,郭鵬輝,陳士恩，歐陽霞輝

(西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030)

從腐乳、泡菜等傳統發酵食品中分離篩選得到七株產蛋白酶能力較強的菌株,分別為菌A、B、C、D、E、F和G。以馬鈴薯蛋白為原料,利用產蛋白酶菌株對其進行發酵,研究馬鈴薯蛋白發酵產物的抗氧化能力。以樣品發酵液對DPPH自由基的清除率為指標,測得七種菌株發酵產物DPPH自由基的清除率分別為:88.32%、92.00%、24.49%、76.90%、53.02%、18.11%、55.69%,菌B的發酵液具有較強的抗氧化能力。

馬鈴薯蛋白,產蛋白酶菌株,抗氧化能力,DPPH自由基清除率

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界上僅次于小麥、水稻和玉米的第四大糧食作物,廣泛分布于100多個國家和地區[1]。研究發現,從馬鈴薯中提取的蛋白質具有多種均衡的氨基酸組分,對人體有重要的生理保健功能。馬鈴薯還含有大量黏體蛋白質,能預防心血管系統的脂肪沉積,保持動脈血管的彈性,防止動脈粥樣化的過早發生,并可預防肝臟、腎臟中結締組織的萎縮,保持呼吸道和消化道的潤滑[2]。然而,在馬鈴薯淀粉加工過程中,馬鈴薯蛋白常作為廢棄物而流失,利用程度不高[3],造成了資源的極大浪費。因此,馬鈴薯淀粉加工副產物的開發與利用越來越受到重視。

研究發現,許多不同來源的水解蛋白都具有一定的抗氧化能力,例如乳清[4-6]、酪蛋白[7]、蛋清蛋白[8]、肌纖維蛋白[9]、大豆蛋白[10-11]、玉米蛋白[12]、蛋黃[13]、鱈魚[14]等的水解物都有一定的抗氧化作用 。Cheng等[15-16]報道了利用Acalase水解得到的馬鈴薯蛋白水解物具有抗氧化活性。國外已有報道從馬鈴薯蛋白中水解出3條抗氧化肽,他們通過對馬鈴薯蛋白水解物組分進行純化,得到三條具有抗氧化活性的多肽,序列為Phe-Gly-Glu-Arg,Phe-Asp-Arg-Arg和Phe-Gly-Glu-Arg-Arg[17]。本課題從食品安全的角度考慮,從腐乳、泡菜等傳統發酵食品中分離篩選得到具有產蛋白酶能力的菌株,以馬鈴薯蛋白為原料,利用篩選到的菌株對其進行酶解發酵,制備馬鈴薯蛋白抗氧化肽,以及馬鈴薯保健產品,從而為馬鈴薯的綜合開發、利用尋找到新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香老太香辣腐乳 桂林香老太食品有限公司;滿口香紅方腐乳 天水紅方腐乳廠;散裝紅腐乳 天水市生產;梅嫂魚酸菜 華容縣田豐菜業有限責任公司。馬鈴薯蛋白(采用堿溶酸沉法提取[18],得率57%,純度72%),從市售馬鈴薯中提取,經冷凍干燥得到。DPPH 美國Sigma公司;葡萄糖、瓊脂、可溶性淀粉、酵母膏、牛肉膏、酪氨酸、蛋白胨、干酪素、豆粕粉、NaCl、MgSO4、KH2PO4、NaOH、Na2CO3、HCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸(TCA)、福林酚試劑、酪氨酸、醋酸、茚三酮顯色劑、抗壞血酸、甘氨酸等試劑均為國產分析純。

JA2003N 電子天平 上海精密科學儀器有限公司;HH-S8A 電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;TG16-WS 臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司;722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;DHP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科學有限公司;101型電熱鼓風干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司;PB-10便攜式臺式酸度計 北京格拉威爾公司;SKY-1102C 恒溫培養振蕩器 上海蘇坤實業有限公司;YXQ-LS-50S11 立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;SW-CF-1CU 潔凈工作臺 上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 產蛋白酶菌株的篩選

1.2.1.1 培養基的制備 PDA培養基:馬鈴薯 200g(去皮,加水煮爛,用八層紗布過濾),葡萄糖 20g,瓊脂 15～20g,水 1000mL;牛肉膏蛋白胨培養基:牛肉膏 5.0g,蛋白胨 10g,NaCl 5.0g,瓊脂 20.0g,水 1000mL,pH7.0～7.2;初篩培養基[19]:可溶性淀粉 1%,酵母膏 0.5%,酪蛋白 1%,KH2PO40.1%,MgSO40.02%,瓊脂 2.0%,pH為7.0;復篩培養基(牛肉膏豆粕浸汁培養基):牛肉膏 0.5%,豆粕汁(稱取200g豆粕粉煮沸,經4層紗布過濾),NaCl 0.5%,瓊脂 2.0%,pH7.2;液體種子培養基[20]:牛肉膏 0.3%,蛋白胨 1.0%,NaCl 0.5%,葡萄糖 1%,pH7.2;液體發酵培養基:蔗糖 1%,2.5%的馬鈴薯蛋白液 5%,NaCl 0.5%。

1.2.1.2 菌株的分離純化 分別稱取香老太香辣腐乳、滿口香紅方腐乳、散裝紅腐乳毛坯和梅嫂魚酸菜汁各5g于三角瓶中,加入100mL無菌水,攪拌均勻,并加入玻璃珠,振蕩15～20min備用。再用無菌水10倍梯度稀釋上述四個樣品的菌懸液到10-8,獲得四個樣品從100到10-8各9個濃度梯度的菌懸液,置于滅過菌的試管中;吸取樣品100～10-8濃度梯度的菌懸液各1mL,分別注入已倒好的PDA平板和牛肉膏蛋白胨平板中,涂布均勻,每個梯度做兩個平行平板。編號并注明日期,將涂布后的平板分別置于溫度28℃(PDA培養基平板)和溫度30℃(牛肉膏蛋白胨培養基平板)的恒溫箱中,培養48h后觀察,挑取生長速度快、具有代表性的單個菌落;將挑選出的具有代表性的菌株接入PDA和牛肉膏蛋白胨試管斜面上,分別編號,在溫度28℃下培養48h后,置于4℃冰箱中保存。

1.2.1.3 初篩 采用透明圈法。挑取分離的菌株,四分法點植于初篩平板上,置于28℃培養2d,觀察菌落周圍是否產生透明圈,若有透明圈產生,則為產蛋白酶菌株;挑選透明圈大的菌株,作為初篩菌株。

1.2.1.4 復篩 將初篩菌株接種于復篩培養基上,做兩個平行平板,觀察其生長情況,挑選透明圈大而沉淀圈小的菌株,作為復篩菌株。

1.2.1.5 產蛋白酶菌株的擴大培養 將復篩得到的菌株各挑取3環,分別接種于50mL液體種子培養基中,且各加入4～6顆玻璃珠,置于振蕩培養箱中進行搖床培養,120r/min下28℃培養2d。

1.2.1.6 產蛋白酶菌株的搖床發酵 把種子培養液按5%的接種量即從種子培養基中吸取5mL種子液接種于液體發酵培養基(250mL的三角瓶每瓶裝100mL培養基,加入4～6顆玻璃珠)中,28℃,120r/min下搖床發酵2d。

1.2.2 生長曲線的測定 進行菌種擴大培養時,每隔4h測定一次發酵液的OD600值,作為確定測定發酵液水解度時間的依據。具體操作為:每隔4h測定一次,每次吸取菌液4mL,稀釋適當倍數后測定OD600值,用未接種的液體種子培養基做空白,其他條件均不變。

1.2.3 蛋白酶活力的測定 采用福林酚法[21]。在溫度40℃下,每1min水解干酪素產生1μg酪氨酸所用的酶量定義為1個酶活力單位。

式中:A-樣品測得的OD值,查與標準曲線相當的酪氨酸數,μg;N-酶的稀釋倍數,100;11.5-反應液體積,mL;20-反應時間,min。

1.2.4 發酵液水解度的測定 采用茚三酮比色法[22],水解度的計算公式如下:

式中:Ah-發酵液中游離-NH2含量,mmol;A0-馬鈴薯蛋白液中原有的游離-NH2含量,mmol;A-馬鈴薯完全水解液中總游離-NH2含量,mmol。

1.2.5 DPPH自由基清除率的測定 取2mL待測樣品于試管中,再加入2mL質量濃度為0.04g/L的DPPH無水乙醇溶液,混合均勻,室溫下暗處靜置20min后,3500r/min離心分離10min,取上清液在517nm處測其吸光度,記為Ai;另取2mL待測樣品于試管中,分別加入無水乙醇,反應20min,3500r/min離心分離10min,取上清液在517nm處測其吸光度,記為Aj;以2mL 0.04g/L DPPH無水乙醇溶液和2mL無水乙醇反應作為參比,其吸光度記為A0。每個樣品平行測定三次。用0.5%抗壞血酸溶液代替樣品發酵液,測定其DPPH自由基清除率做為對照。DPPH自由基清除率的計算公式如下[23-25]:

式中:A0-DPPH無水乙醇溶液+無水乙醇的吸光度;Ai-DPPH無水乙醇溶液+待測樣品的吸光度;Aj-無水乙醇+待測樣品的吸光度。

2 結果與討論

2.1 產蛋白酶菌株的篩選

從四種樣品中共篩選出7株長勢相對較好、產蛋白酶能力較強的菌株,篩選菌株情況見表1、圖1。

表1 篩選菌株的情況

圖1 篩選菌株的情況Fig.1 The situation of the screening of strains

由圖1可以看出,菌A、B、D、E、G的水解圈較大,菌C、F的水解圈較小,水解圈的大小與菌株水解蛋白質的能力和所產生蛋白酶的活力有直接關系。由于時間關系,本研究還未對以上篩選出來的菌株進行菌種鑒定,將在后續工作中進行更深入的研究。

2.2 菌株的生長曲線

以間隔時間為橫軸,所測得的OD600值為縱軸,繪制這七株菌的生長曲線,見圖2。

圖2 各菌株生長曲線隨時間的變化Fig.2 The change of each strain growth curve over time

由圖2可以看出,七株菌都基本滿足典型的對數生長曲線圖,但各菌株到達其自身生長拐點的時間長短有所差異。在培養20h之后,各菌株的生長繁殖趨于穩定,即在20～24h達到生長穩定期,故以此確定蛋白酶活力和發酵液水解度的最佳測定時間為培養24h左右。

2.3 蛋白酶活力的測定

2.3.1 酪氨酸標準曲線 以酪氨酸溶液的質量濃度為橫坐標,以波長為680nm下的吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。酪氨酸標準曲線見圖3。

圖3 酪氨酸標準曲線Fig.3 The standard curve of tyrosine

由圖3可以看出,酪氨酸標準曲線:y=0.0082x+0.0154,R2=0.9993,說明該標準曲線在酪氨酸濃度為0～100μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.3.2 蛋白酶酶活力的測定結果 采用福林酚法[20],對篩選的七株菌株所產的蛋白酶進行酶活力測定,結果如圖4所示。

圖4 不同菌株蛋白酶活力的測定結果Fig.4 The determination results of different strains of protease activity

由圖4可得,在發酵過程中,菌株酶活力的排列順序為菌B>菌D>菌G>菌A>菌C>菌E>菌F,測得菌B在發酵過程中的蛋白酶活力最高(3032±6.6468U/mL)。

2.4 發酵液水解度的測定

2.4.1 甘氨酸標準曲線 甘氨酸標準曲線如圖5所示,y=0.0399x+0.0384,R2=0.9990,其中x為甘氨酸的濃度(μg/mL),y為吸光值,說明該標準曲線在甘氨酸濃度為0～50μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

圖5 甘氨酸標準曲線Fig.5 The standard curve of glycine

2.4.2 水解度的測定結果 由圖6可得,樣品發酵液水解度的排列順序為菌B>菌D>菌A>菌E>菌G>菌C>菌F,測得菌B在發酵過程中發酵液水的解度為7.38%±0.09%。綜合圖4和圖6的結果可以得到,水解度和蛋白酶活力之間呈現正相關關系,菌B產生的蛋白酶活力最高,且其發酵液的水解度也最高;菌D次之。對比圖1水解圈實驗結果可得,水解圈的大小與蛋白酶活力成正比,但水解圈的大小并不能反映水解程度的高低,必須通過實驗來進行測定。

圖6 不同菌株發酵液水解度的測定結果Fig.6 The determination results of the degree of hydrolysis of different strains fermented liquid

2.5 發酵液的抗氧化活性

七株菌株發酵馬鈴薯蛋白得到的發酵液的水解度分別為6.63%、7.38%、0.29%、7.01%、5.23%、0.27%和2.28%,它們對0.04g/L的DPPH自由基的清除能力如圖7所示,與0.5%抗壞血酸溶液對DPPH自由基的清除率85.56%±0.0029%相比,菌B發酵液的清除能力最強,清除率高達92.00%±0.0022%,菌A蛋白酶的清除能力達到88.32%±0.0017%,菌D蛋白酶的清除能力為76.9%±0.0023%,菌E、G的酶解液也有一定的清除能力,其清除率分別為53.02%±0.0016%和55.69%±0.0033%;菌C、F蛋白酶的清除能力較弱,只有24.49%±0.0057%和18.11%±0.0012%。

圖7 不同菌株蛋白酶發酵液的抗氧化能力Fig.7 Antioxidant capacity of different strains of protease fermented liquid

3 結論

采用水解圈篩選模型從腐乳、泡菜等蛋白發酵食品中分離篩選得到具有產蛋白酶能力的菌株,以馬鈴薯蛋白為原料,利用產蛋白酶菌株對其進行酶解發酵,制備馬鈴薯蛋白抗氧化肽。不同菌株的產蛋白酶能力不同,蛋白酶活性不同,且對馬鈴薯蛋白的水解效率也有所不同;菌株所產生的蛋白酶活力與其對發酵液的水解度之間呈現正相關關系。在蛋白酶活力的測定實驗中,發酵培養24h左右時,測得菌B的蛋白酶活力最高,為3032±6.6468U/mL。同樣,在水解度的測定實驗中,菌B所產蛋白酶的水解效率最高,為7.38%±0.09%。在抗氧化肽活性的測定實驗中,以發酵液對DPPH自由基的清除率為指標,菌B表現出了很強的對DPPH自由基的清除能力,其清除率為92.00%±0.0022%。故綜合上述結果得出,菌B為最佳產蛋白酶菌株。

[1]陳志成.薯類精深加工利用技術[M].北京:化學工業出版社,2003:3-19.

[2]張澤生,劉素穩,郭寶芹,等.馬鈴薯蛋白質的營養評價[J].食品科技,2007(11):219-221.

[3]王卓,顧正彪,洪雁.馬鈴薯渣的開發與利用[J].中國糧油學報,2007,22(2):133-136.

[4]Pena-Ramos EA,Xiong YL. Antioxidative activity of whey protein hydrolysates in liposomal system[J]. J Dairy Sci,2001,84:2577-2583.

[5]Pena-Ramos EA,Xiong YL,Arteaga GE. Fractionation an drolyzed whey protein[J]. J Sci Food Agric,2004,84:1908-1918.

[6]Hernandez-Ledesma B,Davalos A,Bartolome B,et al. Preparation of antioxidant enzymatic hydrolysates from α-lactalbumin and β-lactoglobulin. Identification of active peptides by HPLCMS/MS[J]. J Agric Food Chem,2005,53:588-593.

[7]Suetsuna K,Ukeda H,Ochi H. Isolation and characterization of free radical scavenging activities petides derive from casein[J].J Nutr Biochem,2000,11:128-131.

[8]Davalos A,Miguel M,Bartolome B,et al. Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis[J]. J Food Prot,2004,67:1939-1944.

[9]Saiga A,Tanabe S,Nishimura T. Antioxidant activity of petides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment[J]. J Agric Food Chem,2003,51:3661-3667.

[10]Chen HM,Muramoto K,Yamauchi F,et al. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein[J]. J Agric Food Chem,1996,44:2619-2623.

[11]Pena-Ramos EA,Xiong YL. Antioxidative activity of soy protein hydrolysates in a liposomal system[J]. J Food Sci,2002,67:2952-2956.

[12]Zhu L,Chen J,Tang X,et al. Reducing,radical scavenging,and chelation properties ofinvitrodigests of alcalasetreated zein hydrolysate[J]. J Agric Food Chem,2008,56:2714-2721.

[13]Park PJ,Jung WK,Nam KS,et al. Purification and characterization of antioxidative peptides from protein hydrolysate of lecithin-free egg yolk[J]. J Am Oil Chem Soc,2001,78:651-656.

[14]Je J,Park P,Kim S. Antioxidant activity of a peptide isolated from alaska pollack(theragra chalcogramma)frame protein hydrolysate[J]. Food Res Int,2005,38:45-50.

[15]Cheng Y,Chen J,Xiong YL. Chromatographic separation and LC-MS/MS identification of active peptides in potato protein hydrolysate that inhibit lipid oxidation in soybean oil-in-water emulsions[J]. J Agric Food Chem,2010,58(15):8825-8832.

[16]Cheng Y,Xiong YL,Chen J. Fractionation,separation and identification of antioxidative peptides in potato protein hydrolysate that enhances oxidative stability of soybean emulsion[J]. J Food Sci,2010,75(9):760-764.

[17]Kudo K,Onodera S,Takeda Y,et al. Antioxidative activities of some peptides isolated from hydrolyzed potato protein extract[J]. J Funct Foods,2009,1(2):170-176.

[18]齊斌,鄭麗雪,樸金苗.馬鈴薯分離蛋白的提取工藝[J].食品科學,2010,31(22):297-300.

[19]楊佐毅,李理,楊曉泉,等.大豆凝乳菌株篩選及其蛋白酶性質的研究[J].食品與發酵工業,2005,31(11):22-25.

[20]武玉娟,曹新志,王柱.腐乳產蛋白酶菌種的篩選[J].農產品加工·學刊,2007,118(11):84.

[21]蛋白酶活力測定法.中華人民共和國專業標準[S]. SB/T10317-1999.

[22]高丹丹,李海星,常通,等.不同蛋白酶水解棉籽蛋白制備抗氧化多肽的研究[J].食品科技,2010,35(2):18-22.

[23]Shimada K,Fujikawa K,Yahara K,et al. Antioxidative properties of xanthan on the antioxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J]. J Agric Food Chem,1991,40:945-948.

[24]Amarowicz R,Naczk M,Shahidi F. Antioxidant activity of various fractions of non-tannin phenolics of canola hulls[J]. J Agric Food Chem,2000,48(7):2755-2759.

[25]王蓓,馬海樂,喬瑋.馬鈴薯渣蛋白抗氧化肽的酶法制備[J].農業機械學報增刊,2010,41:198-201.

Preparation of antioxidant peptide by fermentation of potato protein

GAO Dan-dan,SUN Qing-qing,GUO Peng-hui,CHEN Shi-en,OUYANG Xia-hui

(College of Life Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China)

Seven protease producing strains were screened from fermented food by using hydrolysis circle screening model,respectively which were named strain A,B,C,D,E,F and G. Potato protein was fermented by the protease producing strains,the degree of hydrolysis and the antioxidant capacity of potato protein fermentation products were investigated. The antioxidant activities of the fermentation products were measured by the scavenging ability of 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH). The results indicated that seven strains fermented product of the DPPH radical scavenging rates were respectively:88.32%,92.00%,24.49%,76.90%,53.02%,18.11%,55.69%. Strain B had the higest antioxidant capacity.

potato protein;protease producing strain;antioxidant activity;DPPH radical scavenging rate

2014-06-11

高丹丹(1983-)，女，博士，副教授，研究方向：食品生物技術。

國家自然科學基金計劃(31360375)；甘肅省青年科學基金項目(1208RJYA012)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0159-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.025