PMP-HPLC-MS分析扇貝內臟多糖的組成

黃 璐,王洪旭,殷 廷,曹九零,溫成榮,宋 爽

(大連工業大學食品學院,國家海洋食品工程技術研究中心,遼寧大連 116034)

PMP-HPLC-MS分析扇貝內臟多糖的組成

黃 璐,王洪旭,殷 廷,曹九零,溫成榮,宋 爽*

(大連工業大學食品學院,國家海洋食品工程技術研究中心,遼寧大連 116034)

本研究以蝦夷扇貝加工副產物內臟為原料制備多糖,采用化學方法測定蝦夷扇貝內臟多糖(SVP)中蛋白質含量為4.09%,中性糖含量為75.37%,硫酸根含量為0.63%,硫酸多糖含量為8.77%,紅外光譜顯示了多糖特征吸收峰。采用PMP-HPLC-PDA-MS分析扇貝內臟多糖酸降解產物,確定主要組成單糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外還含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc;并由二糖片段推測扇貝內臟中存在硫酸軟骨素或其類似物,以及三種結構中存在糖醛酸與己糖重復二糖片段的多糖。本研究提供了扇貝內臟多糖的信息,有助于這一加工副產物的開發利用。

扇貝,內臟,多糖,PMP-HPLC-MS

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)是貝類水產品的重要品種,可加工貝柱和柱連籽產品,而內臟是加工的副產物,作為低值飼料使用甚至被丟棄。殷紅玲等[1]對蝦夷扇貝內臟多糖的酶解提取方法進行了優化,并證實提取出的蝦夷扇貝內臟多糖具有羥基自由基清除活性。閆雪等[2]從蝦夷扇貝內臟中提取純化得到的多糖組分SVP-12,并測定了它的硫酸根含量,氨基己糖含量,分子質量,氣相色譜法分析了單糖組成。李廣靖等[3]從蝦夷扇貝軟體部下腳料中提取出糖胺聚糖,并證實它具有一定的抗氧化活性和低弱的抗凝血活性。本研究將借助化學和儀器方法,分析蝦夷扇貝內臟中多糖的種類和結構特征,為開發利用這一生物資源提供線索和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis) 由大連獐子島漁業集團股份有限公司提供。將新鮮蝦夷扇貝內臟取出,冷凍干燥,粉碎,過20目篩,得扇貝內臟粉,儲藏于-20℃冰箱中備用。胰蛋白酶(250N.F. U/mg)、木瓜蛋白酶(3500U/mg)、肝素、透明質酸 購自生工生物工程(上海)股份有限公司;木糖、D-葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、硫酸軟骨素、D(+)-氨基半乳糖鹽酸鹽、D-核糖 購自Sigma;巖藻糖、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、鼠李糖 購自Fluka;D-半乳糖 購自BIO BASIC INC;PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮) 購自國藥集團有限公司;其他試劑均為國產分析純。

UV-2100型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;液相色譜線性離子阱質譜儀 德國賽默飛世爾科技公司;傅里葉變換紅外光譜儀 美國鉑金埃爾默儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SVP的制備 蝦夷扇貝內臟粉加入25倍水,用6mol/L的NaOH調pH至8.0,溫度37℃,加入2.0%的胰蛋白酶,水解4h后,升溫至50℃,再加入2.0%木瓜蛋白酶,水解4h后,升溫至100℃滅酶10min,冷卻至室溫后,調至中性,離心10min(4000r/min),取上清液加3倍體積95%乙醇,醇沉12h,離心10min(4000r/min),取沉淀,冷凍干燥得扇貝內臟粗多糖。將扇貝內臟粗多糖配成質量分數為5%的水溶液,用NaOH調節至pH為9,然后加七分之一體積的30%H2O2,在60℃水浴條件下加熱2h,取出冷卻至室溫,加3倍體積無水乙醇,醇沉12h,離心,取沉淀,冷凍干燥后得到SVP,得率1.11%。

1.2.2 SVP的組成分析 蛋白質含量采用福林酚法測定[4],中性糖含量采用苯酚硫酸法測定[5],硫酸根含量采用明膠-比濁法測定[6],硫酸多糖含量以硫酸軟骨素為對照品采用1,9二甲基亞甲藍光度法測定[7]。

1.2.3 紅外光譜分析 將樣品分別與KBr以1∶100(W/W)比例混合研細后,以KBr為本底,在4000～400cm-1波數范圍內掃描紅外吸收。

1.2.4 PMP柱前衍生化法分析SVP的組成

1.2.4.1 糖樣的制備 稱取SVP 4mg,分別溶于1mL 2mol/L的三氟乙酸中,充N2密封,在121℃的條件下水解2h,冷卻后旋轉蒸發去除三氟乙酸,加水溶解繼續旋蒸直至無酸味,得扇貝內臟多糖的單糖水解物。

稱取扇貝內臟多糖(SVP)、肝素(HP)、硫酸軟骨素(CS)、透明質酸(HA)、鮑魚性腺硫酸多糖(AGSP)各4mg,分別溶于1mL 1mol/L的三氟乙酸(TFA)中,充N2密封,在110℃的條件下水解3h,冷卻后旋轉蒸發去除三氟乙酸,加水溶解繼續旋蒸直至無酸味,得到含二糖片斷的水解物。

1.2.4.2 PMP衍生物的制備 各種水解物溶于2mL氨水中,混合標準單糖溶于5mL氨水中,分別取混合標準單糖和10種標準單糖溶液100μL與100μL的PMP/甲醇溶液(0.3mol/L)混合,分別取SVP水解物200μL與200μL的PMP/甲醇溶液(0.3mol/L)混合,將所有混合液均放置在70℃下反應30min。取出后冷卻至室溫,加入1.5mL純水,旋轉蒸發去除氨水,重復2次。干燥后的物質用1mL純水及1mL氯仿溶解,充分振蕩后除去有機相,重復3次,靜置,取上清液過0.22μm水相膜,用于HPLC-PAD-MS分析。

標準單糖甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、巖藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、氨基葡萄糖(GlcN)、氨基半乳糖(GalN)、核糖(Rib)、阿拉伯糖(Ara)(各10mg),也按照上述操作進行衍生化,作為對照品使用。按照摩爾比為0.1mmol準確稱取各單糖(不含Ara)作為單糖混合對照品,按照上述操作進行衍生化。

1.2.4.3 HPLC-PAD-MS分析 儀器:配備電噴霧離子源(ESI)和光電二極管陣列檢測器(PDA)的LXQ線性離子阱質譜儀,XCalibur軟件操作系統。

色譜條件:Silgreen ODS C18(250×4.6mm,5μm)色譜柱;柱溫30℃;流動相20mmol乙酸銨-乙腈(78∶22,V/V);流速1mL/min。

質譜條件:離子源ESI源;噴霧電壓4.5kV;毛細管溫度為275℃;毛細管電壓為37V;鞘氣:40AU;輔助氣:10AU;正離子模式檢測;掃描方式為全掃描(Full Scan);掃描范圍為100～2000(m/z)。

2 結果與討論

2.1 SVP組分分析結果

SVP蛋白質含量為4.09%,表明已經基本去除了蛋白質。中性糖含量較高,為75.37%。硫酸根含量為0.63%,硫酸多糖含量為8.77%。

2.2 SVP紅外光譜分析結果

SVP的紅外光譜如圖1所示,顯示了多糖的吸收特征。在3422cm-1處有強且寬的吸收峰,系多糖上的O-H的伸縮振動;2935cm-1附近的肩峰為飽和C-H伸縮振動的信號;1655cm-1處較強吸收,可能是C=O鍵的伸縮振動,或是酰胺鍵中N-H鍵的變角振動;1040cm-1處強吸收為C-O伸縮振動;1413cm-1處的吸收峰為硫酸基的特征吸收;而1250cm-1吸收峰可歸屬為-OSO3基團的S=O伸縮振動。

圖1 SVP紅外光譜Fig.1 IR spectrum of SVP

2.3 SVP單糖組成測定結果

圖2 SVP單糖PMP衍生物液相色譜圖。Fig.2 Chromatograms of PMP-labeled monosaccharides in SVP.注:圖A為紫外檢測器(245nm)色譜圖,圖B、C、D、E、F分別為提取m/z 510.23,511.21,481.20,495.22,525.19離子的色譜圖。

與薄層色譜法和氣相色譜法相比,PMP柱前衍生化液相色譜法分析復雜多糖單糖組成更為有效[8]。但是,使用HPLC-UV分析時,常常會發生不同單糖PMP衍生物保留時間近似而難以區分的現象,另外,雜質峰也會干擾指認。本研究以HPLC-PAD-MS對單糖的PMP衍生物進行檢測,利用PAD和MS的定性作用,對色譜峰進行定性辨別。在質譜中,由于不同類型單糖的分子量不同,生成的PMP衍生物的準分子離子峰質荷比不同。氨基己糖(如GlcN和GalN)、己糖(如Man、Glc和Gal)、戊糖(如Ara,Rib和Xyl)、甲基戊糖(如Rha和Fuc)、己糖醛酸(如GlcA和GalA)PMP衍生物準分子離子峰的理論質荷比分別為510.23、511.21、481.20、495.22和525.19。

本實驗是通過與標準單糖保留時間、紫外光譜、質譜信息進行對比,指認各色譜峰。如圖2所示,采用選擇離子方式,可以依據分子量差別分別顯示各類型單糖。但需要說明的是,該方法仍不能區分保留時間相同的同分異構體,Ara和Xyl,而據文獻報道它們均大量存在于蝦夷扇貝內臟多糖中[2,9]。最終,判斷SVP中的主要組成單糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外還含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc。其中,GlcN,GalN,GalA由于含量較少,在紫外色譜圖中難以分辨(圖2A),而質譜技術提高了靈敏度(圖B和F)實現了檢出。這三種單糖常見于糖胺聚糖中,它們的存在提示扇貝內臟可能存在糖胺聚糖,而糖胺聚糖的種類還需下步實驗分析。

2.4 SVP種類的分析結果

在酸水解中,糖醛酸的糖苷鍵是最難斷裂的,因此,在較弱的酸水解條件下,可以產生非還原端為糖醛酸的二糖片段。本研究是通過鑒定多糖水解產生的二糖片段,間接推斷含糖醛酸多糖的種類。該方法未見文獻報道。通過對SVP水解物的PMP-HPLC-PAD-MS分析,發現了四種二糖片段,它們的PMP衍生物分子離子峰質荷比有兩種,m/z 686和m/z 687。

由分子離子峰m/z 686推測該二糖為糖醛酸與氨基己糖連接而成。而廣泛存在于扇貝組織中的糖胺聚糖[10-12]就是由糖醛酸與氨基己糖組成,包括肝素(HP),硫酸軟骨素(CS)和透明質酸(HA)等。經過酸水解,肝素將生成IdoA-(1→4)-GlcN,硫酸軟骨素將生成GlcA-(1→3)-GalN,透明質酸將生成GlcA-(1→3)-GlcN,它們PMP衍生物的分子離子峰理論均為m/z 686.3。如圖3所示,選擇離子m/z 686.3得到的色譜圖中,SVP的二糖PMP衍生物的保留時間與硫酸軟骨素的一致,說明扇貝內臟中可能存在硫酸軟骨素或其它可水解得該二糖片段的多糖。該二糖及其PMP衍生物結構如圖4所示。

圖3 SVP(A),HP(B),CS(C)以及HA(D)降解物中二糖PMP衍生物的選擇離子m/z 686.3色譜圖Fig.3 Chromatograms of PMP-labeled disaccharides in SVP(A),HP(B),CS(C)and HA(D) with extracted ion at m/z 686.3

圖4 GlcA-(1→3)-GalN及其PMP衍生物的結構Fig.4 Structures of GlcA-(1→3)-GalN and its PMP derivative

由分子離子峰m/z 687推測該二糖為糖醛酸與己糖連接而成。如圖5A所示,選擇離子m/z 687.3獲得的色譜圖中可見三個色譜峰,說明扇貝內臟中存在三種由糖醛酸與己糖重復二糖片段構成的多糖。目前,對這種類型多糖的研究開發還較少,缺少商品化的標準品。本課題組前期從鮑魚性腺中分離得到的多糖(AGSP)主鏈結構由GlcA-Man重復二糖片段構成,酸水解可產生GlcA-(1→2)-Man,該二糖及其PMP衍生物結構如圖6所示[13]。如圖5B所示,AGSP的二糖PMP衍生物的色譜峰對比,推測扇貝內臟中存在AGSP或其它可水解得該二糖片段的多糖。

圖5 SVP(A)和AGSP(B)二糖衍生物選擇離子色譜圖。其中,提取的離子質荷比為687.3Fig.5 Chromatograms of PMP-labeled oligosaccharides with extracted ions at m/z 687.3 in SVP(A)and AGSP(B)

圖6 GlcA-(1→2)-Man 及其PMP衍生物的結構Fig.6 Structures of GlcA-(1→2)-Man and its PMP derivative

3 結論

SVP中蛋白質含量為4.09%,中性糖含量為75.37%,硫酸根含量為0.63%,硫酸多糖含量為8.77%,紅外光譜中具有多糖特征吸收峰。采用PMP-HPLC-PDA-MS分析SVP的單糖組成,SVP中的主要組成單糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外還含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc。通過HPLC-PDA-MS對酸降解產物中二糖的分析,推測扇貝內臟中存在硫酸軟骨素或其類似物、AGSP或其類似物以及另外兩種結構中存在糖醛酸與己糖重復二糖片段的多糖,首次實現了對蝦夷扇貝內臟中多糖種類的鑒定。該方法是通過鑒定多糖酸水解產生的二糖片段來推斷含糖醛酸多糖的種類,避免了繁瑣的分離純化過程,使用樣品量較少,可在較短時間內可獲得結果。這種鑒別多糖的方法未見文獻報道。本研究較為全面深入的提供了扇貝內臟中多糖的信息,為開發利用扇貝內臟提供了基礎的研究數據。

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Composition analysis of polysaccharides from viscus ofPatinopectenyessoensisby PMP-HPLC-MS

HUANG Lu,WANG Hong-xu,YIN Ting,CAO Jiu-ling,WEN Cheng-rong,SONG Shuang*

(School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,National Engineering Research Center of Seafood,Dalian 116034,China)

Polysaccharides were prepared from viscus ofPatinopectenyessoensis,and the contents of neutral sugar,protein,sulfate,sulfated polysaccharides were determined as 75.37%,4.09%,0.63% and 8.77%,respectively,by chemical methods. IR spectrum showed characteristic absorption of polysaccharides. Acid hydrolysates of the polysaccharides fromPatinopectenyessoensisviscus were analyzed by PMP-HPLC-PDA-MS. The results indicated that Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc and Ara were the main components,whereas others,e.g. GlcN,GalN,GalA and Glc,were in a minor content. In addition,chondroitin sulfate or its analogue as well as three polysaccharides composed of a hexose and a hexuronic acid were found by analyzing the resulting disaccharides. This research provided information of polysaccharides in the scallop viscus,and helped to exploit and re-utilize this processing by-product.

Patinopectenyessoensis;viscus;polysaccharide;PMP-HPLC-MS

2014-11-05

黃璐(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：海洋食品生理活性物質。

*通訊作者:宋爽(1981-),女，博士，講師，研究方向：海洋天然產物研究。

國家自然科學基金(31301431)；遼寧省教育廳一般項目(L2014222)；遼寧省農業領域青年科技創新人才培養計劃(2014002)；國家火炬計劃(2012GH560223)；國家高技術發展計劃(863計劃)課題(2014AA093602)。

TS254.9

A

1002-0306(2015)07-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.015