凍干保護劑對復合低溫乳酸菌發(fā)酵劑的影響

張 炎,張衛(wèi)兵,宋雪梅,楊 敏,田菊梅,梁 琪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅省功能乳品工程實驗室,甘肅蘭州 730070)

凍干保護劑對復合低溫乳酸菌發(fā)酵劑的影響

張 炎,張衛(wèi)兵,宋雪梅,楊 敏,田菊梅,梁 琪*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅省功能乳品工程實驗室,甘肅蘭州 730070)

以青藏高原牧區(qū)分離篩選出的低溫乳酸菌為研究對象,以活菌數(shù)為指標,比較了4種凍干保護劑對復合低溫乳酸菌發(fā)酵劑的影響,并通過正交實驗優(yōu)化了其中3種較優(yōu)凍干保護劑的復配配方。結(jié)果表明,復合低溫乳酸菌凍干保護劑的最優(yōu)組合為:甘油為8mL/L,蔗糖為10%(w/v),脫脂乳為15%(w/v),以此為保護劑凍干存活率達到了90.55%。與商業(yè)發(fā)酵劑相比,低溫發(fā)酵劑發(fā)酵酸乳組織狀態(tài)良好,滴定酸度為92°T,感官評分為95分,活菌含量(10.3lgCFU/mL)極顯著高于商業(yè)發(fā)酵酸乳(p<0.01)。實驗結(jié)果為制備高活力直投式低溫乳酸菌發(fā)酵劑的凍干菌粉提供理論支撐,對開發(fā)低溫乳酸菌發(fā)酵劑具有重要意義。

低溫乳酸菌,凍干保護劑,發(fā)酵劑

酵乳的良好風味是多種物質(zhì)相互平衡的結(jié)果,一般需要12～24h完成香味物質(zhì)的積累,我國牧民生產(chǎn)酸乳屬于典型的自然發(fā)酵,由于牧區(qū)常年溫度較低,因此牧區(qū)生產(chǎn)酵乳屬于低溫發(fā)酵(20～25℃),隔夜發(fā)酵即成風味良好的發(fā)酵酵乳[1]。國內(nèi)外對于低溫乳酸菌的研究多集中于冷藏肉、發(fā)酵肉制品及泡菜中[2-5]。Salama等[6]研究了分離自植物資源中的乳酸乳球菌乳脂亞種,結(jié)論是21℃下發(fā)酵需要17～18h凝乳。李靜等[7]研究了低溫發(fā)酵酸乳的品質(zhì),結(jié)果表明在25℃菌株發(fā)酵的酸乳凝乳狀態(tài)較好,后酸化較弱,低溫也有利于產(chǎn)香物質(zhì)的積累。

發(fā)酵劑是決定發(fā)酵乳品質(zhì)的一個重要因素。普通發(fā)酵劑存在著含菌量低、制作過程繁雜、易染雜菌和噬菌體等種種弊端,目前已被活力高、使用方便的直投式發(fā)酵劑取而代之。高濃度菌液在經(jīng)過真空冷凍干燥時,細胞會因冰晶的形成受到機械損傷,同時細胞膜完整性也會遭到破壞[8-9]。凍干保護劑不僅能提高菌體在凍干過程中的抗性,還可以將菌體包裹在介質(zhì)中,減少菌體與氧的直接接觸,提供良好的休眠環(huán)境,延長菌株保藏期[10-11]。因此,在凍干時添加合適的保護劑是一種很好的保護措施。

我國缺乏商品化乳酸菌發(fā)酵劑,且目前發(fā)酵乳大部分屬于高溫短時間發(fā)酵(42℃左右發(fā)酵3～4h),此種發(fā)酵雖然發(fā)酵速度快,但在貯藏過程中會出現(xiàn)后酸化強、乳清析出、乳酸菌活菌數(shù)偏低、酸乳特有風味不足等質(zhì)量問題[12-14]。因此,本實驗以牧區(qū)分離篩選出的低溫乳酸菌為研究對象,對冷凍干燥過程中影響較大的保護劑做了研究,確定了最佳復合保護劑配方,并對菌粉的發(fā)酵性能進行了測定,為制備高活力直投式低溫乳酸菌發(fā)酵劑的凍干提供理論支撐,對開發(fā)低溫乳酸菌發(fā)酵劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器1.1.1 實驗材料 實驗菌株:Lactococcuslactissubsp. Lactis Q8(保藏號:CGMCC4776);LactobacilluscaseiG5(保藏號:CGMCC4775) 甘肅省功能乳品工程實驗室分離并保藏于中國普通微生物菌種保藏中心。

市售脫脂乳粉 黑龍江完達山乳業(yè)股份有限公司;鮮牛奶 甘肅農(nóng)業(yè)大學奶牛養(yǎng)殖基地。商業(yè)酸奶發(fā)酵劑:BP-32直投式凍干發(fā)酵菌粉 法國丹尼斯克公司。

試劑:蛋白胨,牛肉膏,酵母膏,瓊脂,等為生化試劑,谷氨酸鈉,甘油,蔗糖,氯化鈉,硫酸銨,氫氧化鈉,草酸,鹽酸等為分析純試劑。

pH6.86緩沖液:50mL 11.876g/L Na2HPO4溶液和50mL 9.078g/L NaH2PO4溶液混勻。

脫脂乳培養(yǎng)基:將脫脂乳粉用蒸餾水復原成12%(W/V)的脫脂乳,115℃滅菌10min;

改良MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10g,牛肉膏10g,胰蛋白胨5g,K2HPO4·3H2O 2g,乙酸鈉5g,葡萄糖23g,吐溫-80 1mL,檸檬酸二銨2g,MgSO4·7H2O 0.58g,MnSO4·4H2O 0.25g,4%土豆汁,6%胡蘿卜汁,8%番茄汁,水1000mL,調(diào)節(jié)pH6.2～6.4,121℃滅菌15min;

計數(shù)培養(yǎng)基:MRS瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.2 實驗儀器 SW-CJ-2FD 超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;立式滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;Primo Star顯微鏡 德國卡爾蔡司公司;LVDV-1粘度計 上海萬磁儀器有限公司;PHS-3C型緊密pH計 上海虹蓋儀器儀表有限公司;BP121S電子天平 德國賽多利斯集團;冷凍真空干燥機 北京速原中天科技有限公司;TGL-20高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司等。

1.2 實驗內(nèi)容

1.2.1 菌種活化 將冷凍保藏的菌株在室溫下解凍后,于無菌條件下接種到MRS液體培養(yǎng)基中富集,再按3%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接到脫脂乳培養(yǎng)基中,25℃恒溫條件下培養(yǎng)至凝乳,重復5～6次以恢復菌株活力,備用。

1.2.2 種子液制備 將活化后的兩菌株,以接種量3%(V/V)分別接入MRS液體培養(yǎng)基,于25℃恒溫振蕩培養(yǎng)14h得到種子液。

1.2.3 收集菌體 將Q8種子液和G5種子液按2∶1(V/V)充分混合后,以3%(V/V)的接種量接入改良MRS液體培養(yǎng)基中,25℃下培養(yǎng)至12h后添加2.0%(v/v)緩沖液,此后每隔2h添加一次緩沖液,16h后結(jié)束發(fā)酵,4℃下5000r/min離心20min,棄去上清液,收集菌體備用。

1.2.4 菌懸液的制備 在前期實驗的基礎上,將上述菌泥與凍干保護劑以1∶3(V/V)比例混合,用旋渦振蕩器充分懸浮,制成懸浮液備用。

1.2.5 冷凍干燥保護劑的篩選

1.2.5.1 谷氨酸鈉對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響 將收得菌泥與保護劑按1∶3(V/V)混合制成菌懸液后,分別將添加5、10、15、20、25g/L谷氨酸鈉的菌懸液分裝于凍干瓶中,每瓶1mL,凍干后計算冷凍干燥后菌體的存活率。實驗重復3次,取平均值。

1.2.5.2 甘油對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響 將收得菌泥與保護劑按1∶3(V/V)混合制成菌懸液后,分別將添加2、4、6、8、10mL/L甘油的菌懸液分裝于凍干瓶中,每瓶1mL,凍干后計算冷凍干燥后菌體的存活率。實驗重復3次,取平均值。

1.2.5.3 蔗糖對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響 將收得菌泥與保護劑按1∶3(V/V)混合制成菌懸液后,分別將添加5%、10%、15%、20%、25%蔗糖的菌懸液分裝于凍干瓶中,每瓶1mL,凍干后計算冷凍干燥后菌體的存活率。實驗重復3次,取平均值。

1.2.5.4 脫脂乳對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響 將收得菌泥與保護劑按1∶3(V/V)混合制成菌懸液后,分別將添加5%、10%、15%、20%、25%脫脂乳的菌懸液分裝于凍干瓶中,每瓶1mL,凍干后計算冷凍干燥后菌體的存活率。實驗重復3次,取平均值。

1.2.5.5 保護劑優(yōu)化正交設計 在單因素基礎上篩選出對菌株保護作用最好的三種保護劑進行正交優(yōu)化,以凍干存活率為指標,篩選出復合保護劑中各保護劑的最佳添加水平。復合保護劑正交實驗因素水平表見表1。

表1 復合保護劑正交實驗因素水平表

1.2.6 乳酸菌的凍干

1.2.6.1 預凍方法 將準備好的菌懸液快速放入-30℃冰箱,進行約8h的預凍。

1.2.6.2 干燥方法 真空冷凍干燥之前對冷凍干燥機進行消毒處理(75%酒精),開機后以2℃/min連續(xù)降溫大約30min,立即將預凍好的樣品放入冷凍干燥箱,蓋好機器后立即開始抽真空,進入干燥狀態(tài)。冷凍干燥約24h之后,從干燥機的透明視窗觀察發(fā)現(xiàn)管內(nèi)沒有明水,同時菌泥內(nèi)部出現(xiàn)很多小孔和縫隙時,結(jié)束冷凍干燥。在真空狀態(tài)下將菌粉包裝好后取出置于4℃低溫保藏。

1.2.7 凍干菌粉發(fā)酵性能測定 將凍干菌粉加入已滅菌的0.85%生理鹽水中,常溫復水30min。將復水菌液按0.03%(w/v)的接種量接種于滅菌的液體脫脂乳培養(yǎng)中,在25℃恒溫培養(yǎng)至凝乳,記錄凝乳時間,測定滴定酸度、活菌數(shù)并進行感官評價,計算凍干存活率。以商業(yè)發(fā)酵劑作對照。

凍干存活率(%)=凍干后菌數(shù)/凍干前活菌數(shù)×100

1.2.7.1 滴定酸度 參考GB/T5413.34-2010,用濃度0.1mol/L的NaOH測定其滴定酸度(以°T表示)。

1.2.7.2 菌體生長的測定 參照Sahadeva等[15]方法,采用稀釋平板法計數(shù)。無菌操作條件下用0.85%無菌生理鹽水將發(fā)酵乳稀釋至一定稀釋度,取0.lmL涂布于計數(shù)培養(yǎng)基上,置于25℃培養(yǎng)48h,進行菌落計數(shù),每個樣品重復3次,活菌數(shù)用lg CFU/mL表示。

1.2.7.3 感官評價 參照Behare等[16]的方法并作一定修改,發(fā)酵乳樣于4℃冷藏24h,由10位具有食品專業(yè)知識的感官評價人員對樣品的感官特征進行綜合界定,感官評價總分100分,評分標準分為色澤10分、滋氣味40分、組織狀態(tài)50分。感官評價標準見表2。

表2 酸奶感官評分標準

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 用Excel整理實驗數(shù)據(jù)并計算標準差,采用SPSS17.0進行最小顯著差異方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 保護劑篩選單因素實驗結(jié)果

2.1.1 谷氨酸鈉對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響 谷氨酸鈉對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響如圖1所示,由圖可知,隨著谷氨酸鈉添加濃度的增加凍干存活率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,但總體來看,谷氨酸鈉對凍干保護的貢獻并不明顯,凍干存活率僅達到23%左右,而且不同濃度之間差異性不明顯。

圖1 谷氨酸鈉對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響Fig.1 Effect of sodium glutamate on freeze-dried survival rates of low temperature LAB

2.1.2 甘油對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響 甘油對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響如圖2所示,由圖可知,隨著甘油添加濃度的增加凍干存活率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。甘油濃度為6mL/L時凍干存活率最大為 47.62%,高于或低于此濃度都不利于凍干保護作用。甘油作為小分子物質(zhì),可以自由透過細胞與胞內(nèi)的水分子發(fā)生水合,延緩水的結(jié)晶,在干燥時又會減緩細胞脫水,有效防止了細胞的死亡,但是以甘油作為凍干保護劑時濃度不宜過高,因為甘油的吸濕性會延長凍干時間,浪費能源。

圖2 甘油對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響Fig.2 Effect of glycerol on freeze-dried survival rates of low temperature LAB

2.1.3 蔗糖對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響 蔗糖對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響如圖3所示,由圖可知,隨著蔗糖添加濃度的增加凍干存活率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當蔗糖添加量為10%時,凍干存活率達到最大值(35.32%)。蔗糖的保護作用源自它在干燥過程中包裹細胞,同時代替水的結(jié)構(gòu)功能,防止蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化,起到抗干燥作用從而發(fā)揮保護作用。

圖3 蔗糖對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響Fig.3 Effect of sucrose on freeze-dried survival rates of low temperature LAB

2.1.4 脫脂乳對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響 脫脂乳對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響如圖4所示,由圖可知,隨著脫脂乳添加濃度的增加凍干存活率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當脫脂乳添加量為15%時,凍干存活率達到最大值(67.06%)。

表4 凍干成品發(fā)酵劑性能檢驗結(jié)果

注:角標為不同小寫字母的每列數(shù)據(jù)之間差異顯著(p<0.05),不同大寫字母的差異極顯著(p<0.01)。

脫脂乳可以保護菌體細胞壁在干燥過程中的損壞,從而提高菌體存活率,而且脫脂乳中其他成份如乳糖也會提高菌體的抗凍性,但是凍干樣品會隨脫脂乳濃度的增加變得粘稠,水分不易蒸發(fā)會導致凍干過程形成大而多的冰晶對菌體造成損傷,所以應選擇合適的濃度添加。

圖4 脫脂乳對凍干發(fā)酵劑菌體存活率的影響Fig.4 Effect of skimmed milk on freeze-dried survival rates of low temperature LAB

2.2 復合保護劑正交實驗結(jié)果

單因素實驗結(jié)果顯示,以某單一物質(zhì)為凍干保護劑時,凍干保護效果均較低,不能滿足凍干產(chǎn)品的活菌數(shù)要求。因此在單因素的基礎上對保護效果較好的三種保護劑進行正交實驗,考察保護劑對存活率的影響,確定三種保護劑的復配濃度。

表3 保護劑正交實驗結(jié)果

從表3中極差結(jié)果可以看出,三種保護劑對菌體凍干存活率的影響各不相同,保護效果從大到小依次為脫脂乳>甘油>蔗糖。正交優(yōu)化最優(yōu)復合凍干保護劑組合為A3B2C2,即甘油濃度8mL/L,蔗糖濃度10%,脫脂乳濃度15%,但是優(yōu)化出最優(yōu)組合未出現(xiàn)在正交實驗組,為了進一步確定正交實驗的準確性,在相同條件下,對A3B2C2組合與A3B3C2組合進行一次驗證實驗。結(jié)果表明,在優(yōu)化組合A3B2C2條件下,凍干存活率達到了90.55%,高于實驗組最大值,因此,確定組合A3B2C2為復合保護劑配方,即以8mL/L甘油,10%蔗糖,15%脫脂乳為低溫乳酸菌的復合保護劑。

2.3 凍干成品發(fā)酵劑性能

將凍干的低溫乳酸菌粉與商業(yè)發(fā)酵劑進行發(fā)酵劑性能對比,結(jié)果見表4。由表可知,低溫發(fā)酵劑發(fā)酵酸乳活菌含量高達10.3lgCFU/mL,極顯著高于商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵酸乳活菌含量(p<0.01),這可能是因為實驗所制發(fā)酵菌粉含菌量高,導致酸奶中活菌基數(shù)大。低溫發(fā)酵劑發(fā)酵的酸乳香味明顯、酸甜適中、組織狀態(tài)良好、無乳清析出,感官評分(95分)顯著高于商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵酸奶(p<0.05)。風味物質(zhì)產(chǎn)生的高峰期一般在4h左右,但酸乳良好風味是由多種物質(zhì)相互平衡導致的結(jié)果,所以要想得到理想的風味,一般需要更長時間才能完成,本實驗制得低溫發(fā)酵劑所需凝乳時間較商業(yè)發(fā)酵劑凝乳時間長,因此低溫長時間發(fā)酵積累了更多的風味物質(zhì),使產(chǎn)品風味濃厚飽滿、酸甜爽口。通過對低溫乳酸發(fā)酵劑與商業(yè)發(fā)酵劑性能的比較,進一步突出了低溫乳酸菌發(fā)酵劑的優(yōu)點。

3 結(jié)論

正交實驗結(jié)果顯示,三種保護劑的保護效果從大到小依次為脫脂乳>甘油>蔗糖。正交實驗優(yōu)化的最優(yōu)復合凍干保護劑組合為A3B2C2,即甘油濃度8mL/L,蔗糖濃度10%,脫脂乳濃度15%,在此優(yōu)化組合條件下,凍干存活率達到了90.55%。將凍干低溫乳酸菌粉與商業(yè)發(fā)酵劑進行發(fā)酵劑性能對比發(fā)現(xiàn),低溫發(fā)酵劑發(fā)酵酸乳屬于常長時間凝乳,滴定酸度為92.2°T,香味明顯、酸甜適中、組織狀態(tài)良好、無乳清析出,感官評分(95分)顯著高于商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵酸奶(p<0.05);活菌含量為10.3lgCFU/mL,極顯著高于商業(yè)發(fā)酵劑活菌含量(p<0.01)。

[1]艾日登才次克. 西藏部分地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中微生物和化學組成分析及乳酸菌的分離鑒定[D]. 呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學,2006.

[2]Borch E,Kant M L,Blixt Y. Bacterial spoil age of meat and cured meat products[J]. International Journal of Food Microbiology,1996,33(5):103-120.

[3]Dykes G A,Cloete T E,Von Holy A. Identification of Leuconostoc species associated with the spoilage of vacuum packaged Vienna sausage bye DNA-DNA hybridization[J]. Journal of Food Microbiology,1994,11(9):271-274.

[4]Dykes G A,Von Holy A. Taxonomic status of atypical Lactobacillus sake and Lactobacillus curvatus strains associated with vacuum packaged meat spoilage[J]. Current Microbiology,1994,28(1):197-200.

[5]Kotzekidou P,Bloukas J G. Effect of protective cultures and packaging film permeability on shelf life of sliced vacuumpacked cooked ham[J]. Meat Science,1996,42(3):333-345.

[6]Salama M S,Musafijia T,Sandine W E. An ecological study of lactic acid bacteria:Isolation of new strains of Lactococcus including Lactococcus lactis subspecies cremoris[J]. Journal of Dairy Science,1995,78(5):1004-1017.

[7]李靜,任發(fā)政,李曉鵬. 低溫發(fā)酵乳品質(zhì)特性研究[J]. 中國奶牛,2011(18):50-54.

[8]蒲麗麗,劉寧,張英華,等. 乳酸菌凍干損傷與保護的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技,2005,26(7):182-183.

[9]朱琳,劉寧,張英華，等. 乳酸菌細胞膜的凍干損傷[J]. 食品科學,2006,27(2):266-269.

[10]Brashears M M,Gilliand S E. Survival during frozen and subsequent refrigerated storage of lactobacillus acidophilus Cells as influenced by the growth phase[J]. Journal of Dairy Science,1995,78(11):2326-2335.

[11]田芬,陳俊亮,霍貴成. 益生菌凍干保護劑優(yōu)化及菌粉保存穩(wěn)定性研究[J]. 食品科技,2012,37(2):15-19.

[12]林琳. 酵乳質(zhì)量檢測結(jié)果與評價[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志,1997,16(1):34-35.

[13]Oliveiraa M N,Sodini I,Remeuf F,et al. Effect of milk supplementation and culture composition on acidification,textural properties and microbiological stability of fermented milks containing probiotic bacteria[J]. International Dairy Journal,2001,11(12):935-942.

[14]秦虹,梁琪,張衛(wèi)兵,等. 源自合作藏區(qū)優(yōu)良乳酸菌的酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(6):231-235.

[15]Sahadeva R P K,Leong S F,Chua K H,et al. Survival of commercial probiotic strains to pH and bile[J]. International Food Research Journal,2011,18(5):1515-1522.

[16]Behare P V,Singh R,Tomar S K,et al. Effect of ExopolySacc-haride producing strains of Streptococcus thermophilus on technological attributes of fat-free lassi[J]. Journal of Dairy Science,2010,93(7):2874-2879.

Effect of cryoprotectant on low temperature lactic acid bacteria complax starter

ZHANG Yan,ZHANG Wei-bing,SONG Xue-mei,YANG Min,TIAN Ju-mei,LIANG Qi*

(College of Food Science and Engineering,Functional Dairy Product Engineering Lab of Gansu,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Low temperature lactic acid bacteria,isolated from traditional fermented yak milk from qinghai-tibet plateau areas were used as the research object. The impact of four kinds of cryoprotectants on the survival rate of lactic acid bacteria complax starter during storage was assessed. Based on the results,orthogonal experiment was adopted to optimize cryoprotectant composition. The results showed that the optimum cryoprotectant composition was glycerol 8mL/L,sucrose 10%(w/v),skimmed milk 15%(w/v). The rank of protection effect on the viable counts was skimmed milk>glycerol>sucrose,and the freeze-dried survival rate was 90.55%. Compared with commercial starter culture,low temperature starter fermented yogurt had better texture,and the acidity was 92°T. The sensory evaluation value was 95 points,and the viable counts(10.3lgCFU/mL)significantly higher than commercial starter culture fermented yogurt(p<0.01).

low temperature lactic acid bacteria;cryoprotectant;starter

2014-05-27

張炎(1983-)，男，碩士，實驗師，研究方向：畜產(chǎn)品加工。

*通訊作者:梁琪(1969-)，女，教授，研究方向:畜產(chǎn)品加工。

蘭州市科技創(chuàng)新人才團隊培育計劃項目(2011-1-144)；蘭州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(2010-1-29)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0144-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.022