格氏李斯特菌脈沖磁場殺菌效果研究

吳 平,曾 義,王薇薇,郁曉晨,任珊珊,馬海樂

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013)

格氏李斯特菌脈沖磁場殺菌效果研究

吳 平,曾 義,王薇薇,郁曉晨,任珊珊,馬海樂*

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013)

以自行研制的脈沖磁場殺菌設備對格氏李斯特菌進行殺菌實驗,研究了格氏李斯特菌的生長時期、脈沖磁場參數(強度、脈沖數),介質參數(溫度、Na+濃度、pH)等對脈沖磁場殺菌效果的影響。結果表明:格氏李斯特菌在對數生長中期對脈沖磁場最為敏感;脈沖磁場對格氏李斯特菌的殺菌效果產生生物學窗口效應,不同的磁場強度殺菌時,2.5T和4.0T殘留率出現谷值;不同的脈沖數殺菌時,25個脈沖數殘留率達到谷值;當介質溫度為30℃時,殘留率最低,較低或較高溫度的介質中,殺菌效果較差;Na+對脈沖磁場的殺菌效果有一定的協同作用;較低或者較高的pH促進了脈沖磁場的殺菌作用,pH為9.0時殘留率最低;對2.5T,25個脈沖數處理的格氏李斯特菌進行掃描電鏡觀察時發現菌體細胞膜破裂,胞內物質外溢,這可能是脈沖磁場造成格氏李斯特菌死亡的原因。

脈沖磁場,格氏李斯特菌,殺菌,窗效應,掃描電鏡

微生物是引起食品腐敗變質的主要因素,目前在食品工業中主要采用熱殺菌技術如巴氏殺菌、UHT殺菌等進行滅菌處理。熱殺菌使食品中腐敗菌細胞內的蛋白質凝固變性,導致細菌失活,但是食品受熱后,常會發生物理或化學性質的變化,造成其色、香、味、組織結構的改變,破壞食品中的天然和營養成分[1-2]。由于熱殺菌技術無法滿足熱敏性食品的殺菌要求,同時,消費者對于食品的品質要求越來越高,因此,非熱加工技術得到了巨大的發展[3]。非熱殺菌在低溫環境下進行,在殺滅微生物的同時,能夠最大限度地保留食品的營養成分和風味。脈沖磁場殺菌技術作為非熱殺菌技術的一種,得到了各方面的關注。到目前為止已經有較多的研究[4-10]表明,高強度脈沖磁場殺菌技術對微生物有一定的殺菌效果。但也有學者認為高強度脈沖磁場不具備殺菌能力[11]。脈沖磁場殺菌的研究還處于初步階段,其真正的殺菌機理還不明確并且存在爭議,其有待學者的進一步研究。格氏李斯特菌是李斯特菌中的一種,它雖對人和動物的危害相對較小,但因可作為致病李斯特菌檢測鑒定的指示菌而受到關注[12]。實驗以格氏李斯特菌為對象,研究脈沖強度、脈沖數,介質溫度、pH、Na+濃度等對脈沖磁場殺菌的影響,從而為高強度脈沖磁場殺菌技術在食品冷殺菌工業化中的應用提供必要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

格氏李斯特菌(ListeriagrayiATCC 19120) 中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC);牛肉浸膏、魚粉蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、戊二醛、無水乙醇、乙酸異戊酯 購置于上海國藥集團化學試劑有限公司;脈沖磁場殺菌設備 自行研制,專利號ZL0322055111;LZ-610H型特斯拉計 湖南婁底市聯眾科技有限公司;LRH-250型生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;IS-RDD3型臺式恒溫振蕩器 南京暢翔儀器設備有限責任公司;YM30Z型高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;WFJ7200型可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;PHS-3TC型酸度計 上海大普儀器有限公司;SW-CJ-2FD型凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;XH-C型漩渦混勻器 常州金壇市醫療器械廠;600型恒溫水浴鍋 江蘇金壇市中大儀器廠。

1.2 工作原理

脈沖磁場殺菌裝置的主體主要包括兩大部分,脈沖磁場發生器和殺菌室。脈沖磁場發生器產生的脈沖磁場通過螺線管作用于殺菌處理室中的物料。此外,殺菌過程也需要一些輔助裝置,磁屏蔽外殼防止漏磁,溫控裝置控制殺菌室的溫度,特斯拉計測量處理室內的磁場強度。脈沖磁場殺菌裝置的電路原理是穩壓直流電源由橋式整流電路提供,儲能電容儲存磁能,晶閘管開關負責電能和磁能的無縫轉換。當開關接通A時,高壓直流電源通過限流電阻R0向電容器充電,至電容器上兩端的電壓為V值。然后將開關接通B,則電容器通過線圈和電阻R放電,在線圈中產生磁場并生成感應電流,接著線圈上的電流又向電容器充電直至接近電壓V值,電容器又沿反方向向電阻R和線圈放電,線圈中又產生反方向磁場[13]。如此反復充放電以產生脈沖磁場。

1.3 實驗方法

1.3.1 脈沖磁場殺菌操作 開機預熱10min,調節調壓旋鈕至所需電壓,用特斯拉計確定所需磁場強度,然后將菌液送入殺菌室進行處理。脈沖數采用人工計數方法。完成一個殺菌作業后,取出菌液,裝置停止工作3min進行冷卻,再進行下一組的殺菌作業。

1.3.2 菌液的制備 取出斜面冷藏的格氏李斯特菌種進行活化,挑取一至三環接入已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養基中,37℃培養10～12h,而后按5%的接種量接入已滅菌的150mL的液體培養基中,37℃,140r/min培養8h后,取5mL菌液進行殺菌實驗。

1.3.3 實驗參數設置 菌液溫度保持在37℃,pH7.4,采用磁場強度2.5T,脈沖數25個對格氏李斯特菌進行殺菌處理,以不經脈沖磁場處理的相同菌液為對照。保持其他條件不變,采取冰浴及恒溫箱冷卻和恒溫水浴鍋加熱的方式控制菌液溫度分別為5、10、15、20、25、30、35、40℃;采用0.5mol/L H3PO4以及0.5mol/L NaOH調節菌液pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0;采用稱量不同質量NaCl固體溶解于培養基中,控制菌液Na+濃度分別為45、55、65、75、85、95、105、115mmol/L。

1.3.4 菌落總數的測定 殺菌完成后,吸取1mL菌液,按1∶10的比例進行梯度稀釋,選取適宜的三個稀釋梯度的菌液,用傾注法進行平板接種,每個稀釋度做三個平行;將接種后的平板在37℃下,培養48h。培養結束后,對平板上的菌落進行計數。以殺菌前的菌液作對照,計算殘留率。格氏李斯特菌殘留率計算公式:

(1)

式中,N為殺菌后菌液中李斯特菌數,CFU/mL;N0為殺菌前的菌數,CFU/mL。

1.3.5 生長曲線的測定 在48支試管(三組平行)中分別分裝已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養基各4.75mL,準確吸取格氏李斯特菌培養液0.25mL接種到上述試管中,37℃,140r/min振蕩培養。每隔1h取出三支試管標號放入冰箱4℃保存,培養時間結束后以未接種的培養基為空白組在600nm下測量OD值。濃度較高的菌液用培養基稀釋適當倍數后測定,記錄OD值時乘以稀釋倍數。以菌懸液的OD值為縱坐標,培養時間為橫坐標,繪制生長曲線。

1.3.6 不同對數生長期的格氏李斯特菌殘留率測定 對分別培養2～10h的格氏李斯特菌在2.5T,25個脈沖下進行殺菌處理,進行菌落計數,計算殘留率。

1.3.7 掃描電鏡觀察 脈沖磁場處理前后的菌液5000r/min離心15min,棄上清液,PBS清洗3次,2.5%的戊二醛在4℃下固定過夜。棄固定液,PBS清洗3次,乙醇梯度脫水(30%、50%、70%、80%、90%、95%)各1次,100%乙醇清洗3次,乙酸異戊酯清洗2次,每次均浸泡15min,10000r/min離心5min。樣品在-20℃冷凍過夜,-80℃凍干12h,備用。以上所有操作均在4℃下進行。

2 結果與討論

2.1 李斯特菌生長時期對殺菌效果的影響

測得格氏李斯特菌的生長曲線如圖1所示,0～1h為延滯生長期,1～11h為對數生長期,12h后進入穩定生長期。

圖1 格氏李斯特菌生長曲線Fig.1 Listeria grayi growth curve

有研究表明微生物處于對數生長期時比延滯生長期和穩定生長期對脈沖磁場更為敏感[9],但關于敏感性在對數生長期的不同時間段是否存在差異的研究卻較少。對培養2、4、6、8、10h處于對數生長期不同時間的格氏李斯特菌進行殺菌,發現格氏李斯特菌處于對數生長期不同時間段對磁場的敏感程度有所不同,處于對數生長中期時,殺菌效果最好,尤其是對培養8h時的格氏李斯特菌進行殺菌時,殘留率最低,如圖2所示。這可能是因為格氏李斯特菌在對數生長中期時繁殖分裂速度最快,正在建立人工感受態,對外界環境變化最為敏感。

圖2 不同對數生長期對脈沖磁場殺菌效果的影響Fig.2 Effect of different logarithmic growth phase on the sterilizing effect of PMF

2.2 脈沖磁場強度對殺菌效果的影響

圖3 脈沖磁場強度對殺菌效果的影響Fig.3 Effect of PMF intensity on the sterilizing effect

菌液初始溫度30℃,菌液pH7.4,脈沖數分別為15、20和25個時,不同磁場強度下的殺菌效果見圖3。由圖3可知,格氏李斯特菌殘留率隨著脈沖磁場強度的增大呈現波動變化趨勢,在2.5T,4T時出現谷值,而在2T,3.5T時出現峰值,這種波動現象在前人的研究中也被頻繁發現,符合電磁波生物學窗效應的特征,該效應是指生物體只有受特定頻率參數與特定強度參數恰當組合的電磁波作用時才能產生最佳作用效果的一種生物學現象。脈沖磁場造成格氏李斯特菌死亡的原因可能是由于菌體細胞膜在周期性脈沖場的反復沖擊下各種離子更易滲透進入細胞中,造成細胞各細胞器發生膨脹[14],胞內壓力超過細胞膜所能承受的壓力后,造成了細胞膜的破裂。3.5T,20個脈沖數處理時,脈沖磁場促進了格氏李斯特菌的生長,這可能是由于3.5T,20個脈沖數處于殺菌效應的窗口外,其促進機理需要進一步的研究。脈沖磁場產生殺菌效應時需要在對應的殺菌窗口中進行,2.5T、4T均是脈沖磁場產生殺菌效應的強度窗口,但高場強下能耗較高,而且2.5T和4T處理時,殘留率沒有顯著性差異(p>0.05),因此后面采用2.5T的脈沖強度進行殺菌實驗。

2.3 脈沖數對殺菌效果的影響

菌液初始溫度30℃,菌液pH7.4,磁場強度2、2.5、3T,不同脈沖數下的殺菌效果見圖4。由圖4可知,隨著脈沖數的升高,格氏李斯特菌殘留率呈波動變化。15、25個脈沖數時出現谷值,10、20個脈沖出現峰值。15、25個脈沖可能是脈沖磁場產生殺菌效應的時間窗口。而3T,10個脈沖、2T,20個脈沖處理時,脈沖磁場促進了微生物的生長。已有研究表明一定范圍內的電磁能可以促進細胞的生長[15-16],但產生的機理尚不清楚。

圖4 脈沖數對殺菌效果的影響Fig.4 Effect of the number of pulses on the sterilizing effect

2.4 介質溫度對殺菌效果的影響

菌液pH7.4,采用磁場強度2.5T,脈沖數25個對格氏李斯特菌進行殺菌處理,不同介質溫度下的殺菌效果見圖5。由圖5知,脈沖磁場處理后,格氏李斯特菌的殘留率在5～30℃范圍內隨著溫度的升高而下降,這說明溫度的升高對脈沖殺菌有一定的協同作用。當達到30℃時,殘留率達到最低63.48%,隨后殘留率又有所增加,這說明低溫或者較高溫度下(遠低于熱力致死溫度),殺菌效果較差,這可能是由于對其不利的環境溫度條件使得該菌發生抗逆性作用而導致對脈沖磁場有一定的抵觸作用。而當環境溫度在格氏李斯特菌最適生長溫度(37℃)附近時,細菌處于代謝增殖的最佳時期,其對脈沖磁場的抵抗性增大,因此殘留率在35℃時有所增加[17]。

圖5 介質溫度對殺菌效果的影響Fig.5 Effect of medium temperature on the sterilizing effect

2.5 Na+濃度對殺菌效果的影響

菌液溫度30℃,pH7.4時,采用磁場強度2.5T,脈沖數25個對格氏李斯特菌進行殺菌處理,在介質中不同的Na+濃度對殺菌效果的影響見圖6。從圖6中可知,隨著Na+濃度的增加,格氏李斯特菌殘留率呈下降趨勢,濃度在45～75mmol/L之間時下降較平緩,85mmol/L之后下降顯著,并在115mmol/L時達到最低殘留率29.41%。這可能是由于前者處于脈沖磁場作用下細胞所能承受的Na+濃度范圍內,而達到85mmol/L后,超出脈沖磁場下細胞所能承受Na+濃度閾值,胞內外滲透壓差顯著增大,導致細胞大量破裂死亡。因此,Na+濃度對脈沖磁場殺菌具有協同作用,且濃度越高殺菌效果越好。

圖6 Na+濃度對殺菌效果的影響Fig.6 Effect of concentration of Na+ on the sterilizing effect

2.6 pH對殺菌效果的影響

菌液溫度30℃,采用磁場強度2.5T,脈沖數25個對格氏李斯特菌進行殺菌處理,不同的pH對殺菌效果的影響見圖7。由圖7可知,不同pH對脈沖磁場殺菌效果有較顯著的影響。當pH為7.5時,殘留率最大,pH7.5是格氏李斯特菌的最適生長pH,此時,細菌生長代謝最快,對脈沖磁場的抗性也較強,因此殺菌效果最差。當菌液是酸性或者堿性時,細菌殘留率顯著降低,說明介質pH不僅對細菌的生長代謝有一定的影響,而且可能使其對脈沖磁場的抗性也發生下降,從而使細菌死亡率增加。當pH大于7.0時,格氏李斯特菌殘留率下降的幅度要比在pH小于7.0的環境中要大,這說明該菌在堿性環境中更易受脈沖磁場的影響而失活。

圖7 介質pH對殺菌效果的影響Fig.7 Effect of medium pH on the sterilizing effect

2.7 掃描電鏡觀察

由圖8可以看出,處理前的格氏李斯特菌呈短桿狀,細胞飽滿,表面光滑。經磁場強度為2.5T,25個脈沖數的脈沖磁場處理后,細胞出現皺縮,表面出現褶皺,細胞與細胞之間發生黏粘。高強度脈沖磁場的反復作用可能造成格氏李斯特菌的細胞膜發生不同大小的電穿孔,一部分出現小孔的細胞膜在處理后的一段時間內會逐漸恢復成原樣;而另一部分出現大孔的細胞膜則發生不可逆破裂,造成胞內物質的溶出,從而導致細胞死亡[18-19]。

圖8 掃描電鏡觀察格氏李斯特菌微觀結構Fig.8 The observation of microstructure of L.Grayi by SEM注：A為脈沖磁場處理前,B為脈沖磁場處理后。

3 結論

3.1 格氏李斯特菌在生長12h后進入穩定生長期,其在對數生長中期(8h)對外加的脈沖磁場更敏感,殺菌效果也更好。

3.2 脈沖磁場的殺菌殘留率出現生物學窗口效應,不同的磁場強度殺菌時,2.5T和4T時殘留率出現谷值;不同的脈沖數殺菌時,25個脈沖數殘留率達到谷值。

3.3 采用2.5T,25個脈沖數對格氏李斯特菌進行殺菌時,隨著溫度的增加,脈沖磁場殺菌殘留率總體呈下降趨勢,在30℃時殘留率達到最低,殺菌效果最好;Na+對脈沖磁場殺菌有一定的協同作用,低濃度的Na+對脈沖磁場殺菌的協同作用較弱,高濃度的Na+對脈沖磁場殺菌的協同作用較強;而過低或過高的pH都會提高殺菌效果。

3.4 掃描電鏡觀察發現,脈沖磁場造成格氏李斯特菌細胞出現皺縮,表面產生褶皺,這可能是外加的脈沖磁場造成了部分菌體細胞膜的破裂,胞內物質外溢,從而導致細胞發生不可逆的死亡。

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Study on the sterilization effect of pulsed magnetic fields onListeriaGrayi

WU Ping,ZENG Yi,WANG Wei-wei,YU Xiao-chen,REN Shan-shan,MA Hai-le*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Effect of different growth phase,pulsed magnetic field(PMF)parameters(intensity,pulsed number),medium parameters(temperature,concentration of Na+,pH)on sterilizing effect ofListeriaGrayiby pulsed magnetic field were studied. The results indicated thatListeriaGrayiwas sensitive to pulsed magnetic field at the middle of log phase. Pulsed magnetic field generated biological window effect on sterilization effect ofL.Grayi. When different intensity used to sterilization,the survival rate reached valley value at 2.5T and 4T. When different pulsed number used to sterilization,the survival rate reached valley value at the number of 25. Low and higher temperature,the sterilization effect was worse,only in 30℃ the survival rate reached the minimum value. Na+had the synergistic effect to sterilization effect. Low and higher pH value increased the sterilizing effect,survival rate reached the minimum value when pH was 9.0. By scanning electron microscope to observe the samples after handled at 2.5T intensity and 25 pulsed number,the result showed that cells membrane rupture and intracellular material spill,this may be the death reason ofL.Grayiby PMF.

pulsed magnetic field;ListeriaGrayi;sterilization;window effect;scanning electron microscope

2014-06-27

吳平(1990-),男,碩士研究生,主要從事食品非熱殺菌方向的研究。

*通訊作者:馬海樂(1963-),男,博士,教授,主要從事食品功能因子及其分離技術研究。

國家自然科學基金資助項目(31271966);江蘇大學科研項目(12A011)。

TS205.9

A

1002-0306(2015)07-0127-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.018