基因芯片與液體快速培養技術診斷耐藥結核病的對比研究

楚麗香 孫波 姜春梅 閆宇 劉玉琴

基因芯片與液體快速培養技術診斷耐藥結核病的對比研究

楚麗香 孫波 姜春梅 閆宇 劉玉琴

目的對比研究基因芯片與液體快速培養技術診斷耐藥結核病的效果。方法 1156例疑似肺結核及肺結核患者的同一痰樣本, 同時應用基因芯片技術(芯片組)與液體快速培養技術(快培組)進行結核菌耐藥檢測, 對兩組檢測結果進行對比分析。結果 對兩組實驗檢測結果進行對比分析, 結核菌檢出率：芯片組270例, 陽性率為23.36%, 快培組237例, 陽性率為20.50%。結核菌耐藥結果：芯片組46例, 耐藥率為17.04%, 快培組43例, 耐藥率為18.14%, 比較差異無統計學意義(P＞0.05)。芯片組與快培組同時檢出結核菌陽性時, 二者耐藥符合率達80%。結論 基因芯片檢測結合聚合酶鏈式反應(PCR)技術和反向雜交技術(RDB)診斷結核病及耐藥結核病, 具有簡便、快速、靈敏、準確的特點, 及時檢出結核病及耐藥結核病, 指導臨床針對性制定個性化抗結核方案, 避免盲目制定抗結核方案而導致醫源性耐藥結核病的出現, 真正有效控制結核病及耐藥結核病。

結核分枝桿菌；耐藥性；基因突變；基因芯片；反向雜交點技術

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選取2013年5月～ 2014年9月在本院就診的1156例疑似肺結核或肺結核患者, 用同一痰樣本同時做結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測與快速液體培養及藥敏檢測, 結核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒(基因芯片法)由亞能生物技術(深圳)有限公司生產, PCR擴增儀、分子雜交儀均由亞能生物技術(深圳)有限公司提供。

1.2 樣本制備 快速液體培養標本參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》［1］結核菌培養標本處理方法處理后進行培養和鑒定, 并進行藥物敏感性實驗。耐藥突變基因檢測的樣本, NaOH消化, 100℃加熱10 min, 13000 r/min離心2 min, 上清液即為DNA模板。

1.3 基因芯片檢測 采用PCR進行基因擴增, 將PCR擴增產物加入裝有基因芯片的雜交管中, 并將混合物加熱至100℃變性10 min, 之后迅速放入分子雜交儀中進行雜交反應, 再將完成雜交的芯片進行洗膜、孵育、顯色等過程, 最后進行結果判讀。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 快培組藥敏檢測結果 在1156例臨床痰樣本中, 共檢出結核分枝桿菌237株, 檢出陽性率為20.50%, 藥敏實驗結果表明其中43株為耐藥株, 耐藥率為18.14%。

2.2 芯片組檢測結果 在1156例臨床痰樣本中, 使用基因芯片共檢出結核分枝桿菌270例, 檢出陽性率為23.36%, 其中46例為耐藥結果, 耐藥率為17.04%。

2.3 基因芯片法與快速液體培養法的結果比較 芯片組與快培組的結核菌陽性檢出率和結核耐藥率比較, 差異無統計學意義(陽性率χ2=2.751, 耐藥率χ2=0.107, P＞0.05), 將兩組數據進行臨床對比分析得出, 芯片組與快培組同時檢出結核菌陽性時, 二者耐藥符合率為80%。見表1。

表1 1156例患者的基因芯片檢測與快速液體培養陽性率及藥敏檢測結果比較［n(%)］

3 討論

傳統的結核菌羅氏培養技術需要3個月才能確定耐藥結核病, 其陽性率不到10%, 最近幾年開展的抗酸分枝桿菌液體快速培養技術, 將檢測時限縮短至7～42 d, 但仍需要先做抗酸分枝桿菌培養, 培養出抗酸分枝桿菌后再做藥敏檢測需要4～15 d, 共計11～57 d, 確定肺結核及耐藥結核病時限仍不能令人滿意, 且陽性率不超過25%, 臨床醫生拿不到實驗室依據確定耐藥結核病, 無法制定個性化抗結核治療方案, 以往的經驗性抗結核方案并不能完全有效控制結核病［1,2］。

目前已知98%以上結核分枝桿菌利福平耐藥性與rpoB基因中一長約81bp片段所編碼的氨基酸突變有關, 其基本機理為正常情況下利福平通過和由rpoB基因編碼的RNA聚合酶β亞基特異性結合, 來阻斷結核菌RNA的合成, 導致結核菌的死亡［3,4］。當rpoB基因突變時利福平不能阻斷結核菌RNA的合成, 也就不能發揮作用。目前已知結核菌異煙肼耐藥性與katG、ahpC、inhA等基因突變有關, 乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥相關基因分別是embB、rpsL基因。

本實驗所采用的結核分枝桿菌耐藥突變基因芯片檢測,結合聚合酶鏈式反應(PCR)技術和反向點雜交(RDB)技術,根據結核分枝桿菌標準株H37Rv序列, 設計了覆蓋rpoB、katG、inhA、embB、rpsL等基因突變區的系列寡核甘酸探針,制作膜芯片, 檢測標本中結核分枝桿菌基因突變情況, 從而確定結核分枝桿菌(MTB)是否存在對利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇4個抗結核一線藥物耐藥。

基因芯片技術對結核菌的檢出率高于液體快速培養, 二者同時陽性者, 耐藥符合率80%, 原因是目前已經確定的結核菌耐藥突變基因主要是上述幾種, 還有未被發現的基因突變, 或探針之外未能檢測到的基因突變, 另外就是痰標本中的結核菌基因突變的位點不完全一致, 目前為止, 還沒有發現結核分桿菌耐藥突變基因檢測結果假陽性者, 基因芯片與結核菌液體快速培養技術及羅氏培養技術可以互補。

基因芯片技術具有快速、靈敏、準確、高通量等特點,因此采用基因芯片法檢測結核分枝桿菌及其耐藥性, 比現有的快培方法更加符合臨床的需要。本檢測最大的優勢在于檢測周期短, 自動化程度高, 能夠及時檢出結核病及耐藥結核病, 指導臨床針對性制定個性化抗結核方案, 避免盲目制定抗結核方案而導致醫源性耐藥結核病的出現, 從而真正有效控制結核病及耐藥結核病。

本項研究實驗結果表明, 采用基因芯片技術與傳統的結核菌液體培養技術比較, 符合率很高。而且只需8 h就能得到結果, 同時獲得四種抗結核一線藥物的耐藥情況, 相較于傳統的結核菌液體培養動輒需要2～8周的時間, 大大縮短了藥敏檢測的時間, 有利于快速指導臨床治療方案。

［1］ 中國防癆協會基礎專業委員會.結核病診斷實驗室檢驗規程.北京:中國教育文化出版社, 2006:54, 56-57.

［2］ 唐神結, 許紹發, 李亮.耐藥結核病學.北京:人民衛生出版社, 2014:96-111.

［3］ 李芳芳, 方紅輝, 何林, 等.結核分枝桿菌耐藥基因rpoB、katG、inhA突變快速檢測方法研究.熱帶醫學雜志, 2005, 5(6): 743-746.

［4］ 單萬水, 吳馳, 陳心春, 等.基因芯片技術在結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測中的應用.國際檢驗醫學雜志, 2008, 29(11): 112-114.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.13.128

2014-12-25］

黑龍江省衛生廳科研課題(項目編號：2013318)

157000 黑龍江省牡丹江市傳染病醫院(楚麗香孫波 姜春梅 閆宇)；黑龍江省結核病防治院(劉玉琴)