節律基因per2在慢性粒細胞白血病中的表達及與bcr／abl的相關性

李 杰，楊 帆，封建凱，孫成銘，黃萬里，張 霞＊

（1.青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院檢驗科，山東煙臺264000；2.棲霞市人民醫院檢驗科；3.濱州醫學院煙臺附屬醫院檢驗科）

節律基因per2在慢性粒細胞白血病中的表達及與bcr／abl的相關性

李 杰1，楊 帆2，封建凱3，孫成銘1，黃萬里1，張 霞1＊

（1.青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院檢驗科，山東煙臺264000；2.棲霞市人民醫院檢驗科；3.濱州醫學院煙臺附屬醫院檢驗科）

目的 探討節律基因per2在慢性粒細胞白血病中的表達及其與白血病融合基因bcr／abl的關系。方法收集30例慢性粒細胞白血病病人和9例健康對照的骨髓標本，RT－PCR檢測per2和bcr／abl融合基因的表達，并分析兩者之間表達的關系；不同濃度甲磺酸伊馬替尼作用K562細胞不同時間后，通過RT－PCR檢測bcr／abl和per2水平變化。結果 研究發現per2在慢性粒細胞白血病中表達降低，并且與bcr／abl的表達呈負相關。用甲磺酸伊馬替尼處理K562發現，隨著bcr／abl的表達降低，per2的表達升高。結論 per2在慢性粒細胞白血病中表達下降，并且和bcr／abl的表達呈負相關，提示per2在慢性粒細胞白血病的發生發展中發揮作用。

慢性粒細胞白血病；K562細胞；per2；bcr／abl

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1481）

慢性粒細胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）是一種造血干細胞惡性克隆增殖性疾病，其遺傳學特征為t（9，22）（q34；q11），產生bcr／ab1融合基因，導致自身及細胞內多種底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化，激活多條信號傳導途徑，干擾細胞的基本活動，導致CML產生。因此，bcr／abl酪氨酸激酶目前被認為是治療CML最理想的分子靶點。最新研究發現，生物鐘系統不僅在晝夜生物節律方面起重要作用，而且參與機體其他功能的調節。該系統一旦失調可能引起一系列嚴重疾病發生，如淋巴瘤、白血病、乳腺癌和抑郁癥等［1］。目前有研究表明per2在腫瘤中表達異常，但是在CML中的表達研究尚少，本研究檢測per2在CML中的表達，以及其與bcr／ab1的關系，探討生物鐘基因per2在CML發生發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 病例資料 所有病例均來自煙臺毓璜頂醫院2009年到2012年的CML患者，經骨髓細胞形態學和染色體檢查符合CML診斷標準。9例造血干細胞移植的健康供者作為正常對照。

1.2 試劑 逆轉錄試劑盒購自Promega公司，PCR試劑盒購自TIANGEN公司，DL2000購自TAKARA公司，Trizol購自Invitrogen公司。引物使用Primer Primier 5.0軟件設計，由上海博亞公司合成。其余生化試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養和藥物干預 慢性粒細胞白血病細胞株K562為本實驗室保存。在含10%小牛血清、100μg／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素的RPMI1640培養基中以37℃，5%的CO2培養。取對數生長期的K562細胞，分別加入0.5，1，5μmol／L的甲磺酸伊馬替尼，分別于24，48h之后收獲細胞用來做RT－PCR檢測。

1.3.2 RNA提取和逆轉錄 將收集的臨床標本和收獲的細胞中加入Trizol試劑1ml，參照Trizol試劑說明書的操作抽提RNA，用分光光度計測定濃度之后，取3μg RNA，用逆轉錄試劑盒得到cDNA，用來進行PCR擴增。

1.3.3 RT－PCR檢測 以逆轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。Per2上游引物：5’ATTCTCCCATTCGGTTTC 3’，下游引物5’GAGGTCTGGCTCATAAGGT 3’；PCR擴增條件為95℃5min，95℃30s，52℃30s，72℃30s，72℃5 min，30個循環。bcr／ab1上游引物5’ATCCGTG－GAGCTGCAGATG3’，下游引物5’TTCCAACGAGCGGCTTCACT3’；β－actin上游引物5 GGCATCGTGATGGACTCCG3’，下游引物5’GCTGGAAGGTGGACAGCGA3’。擴增產物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳，UVP掃描并分析結果。

1.3.4 統計學處理 采用Prism 4.03統計軟件進行統計分析，用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較行t檢驗，采用相關性分析的方法分析bcr／abl和per2表達的關系，P＜0.05，表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 per2在慢性粒細胞白血病病人中表達明顯降低 RT－PCR結果顯示，與健康對照組相比，慢性粒細胞白血病病人表達per2明顯降低。進一步分析9例健康對照和30例慢性粒細胞白血病人中的per2的表達，發現其差異具有統計學意義，P＜0.05（見圖1）。

圖1 RT－PCR檢測per2和bcr－abl的表達

2.2 per2和bcr／abl在CML中的表達呈負相關對同時進行per2和bcr／abl檢測的30例慢性粒細胞白血病人的標本進行相關性分析發現，per2和bcr／abl在慢粒病人中的表達呈負相關，r＝－0.3778，P＜0.05，具有統計學意義（見圖2）。

在K562細胞中，用伊馬替尼抑制bcr／abl的表達后，per2表達升高為了進一步確定per2和bcr／abl在慢性粒細胞白血病中的關系，我們用伊馬替尼處理CML細胞系K562，結果發現處理24和48小時之后，bcr－abl的表達下降，而且per2的表達上升，如圖3所示，1μM和5μM的伊馬替尼處理24小時和48小時之后，per2的表達均有明顯上調，差距有明顯的統計學意義（P＜0.05）。

圖2 per2和bcr－abl表達的相關性分析

圖3 伊馬替尼處理K562細胞后per2和bcr－abl的表達

3 討論

節律系統普遍存在于生物界，當其系統異常或其基因突變時，機體正常機能將被打亂，甚至產生一些疾病，如心血管疾病、神經系統疾病以及腫瘤等。機體通過近日節律調控原癌基因、抑癌基因及凋亡基因的表達，對腫瘤發生具有直接或間接的作用，一旦生物鐘基因表達異常引發節律改變即可促使腫瘤生長或患癌風險增加。目前，已經識別的哺乳動物的晝夜節律由一個自動調整的轉錄－翻譯反饋回路組成，包括4種基因／蛋白質：BMal1，Clock，Cryptochrome和Period。其中per基因分為per1，per2，per3，研究顯示Per基因在多種類型的白血病和淋巴瘤中表達下調，per2敲基因小鼠與野生小鼠相比發生淋巴瘤的幾率增加10倍［2］。研究大量白血病和淋巴瘤病人以及正常對照骨髓和扁桃體中per2的表達顯示，per2的表達在AML和DLBCL中表達明顯下調［3］。

在本研究中，我們選用了全新的病例，結果與本課題組前期研究一致［4］，發現per2在CML病人骨髓中的表達降低，并且和bcr／abl的表達呈負相關，為了進一步驗證該結論，在細胞系K562中通過甲磺酸伊馬替尼處理細胞后，隨著bcr／abl的表達降低，per2的表達升高。曾有學者研究per基因在CML病人的外周血比正常人的表達降低，和我們的研究結論是一致的，并且在CML病人中經常發現per2和per3啟動子的CpG發生甲基化，在原始細胞危象的病人中per3甲基化的頻率比在慢性期的病人中明顯要高［5］，提示我們per2基因的表達降低可能由于其存在高頻率的甲基化。另有體外細胞培養實驗表明在人類和小鼠AML和前B淋巴細胞中強迫表達per2可以引起細胞生長抑制，細胞周期阻滯，凋亡和喪失克隆能力［6，7］。在人白血病細胞的體外研究中發現C／EBPα誘導per2表達至少在一定程度上參與了C／EBPα的腫瘤抑制功能［8，9］。

bcr－abl基因的產生是慢性粒細胞白血病的重要發生機制，基于此機制的靶向治療藥物酪氨酸激酶抑制劑的應用使CML治療大為改觀，但其耐藥的產生使其遠期療效仍不容樂觀，通過本研究為尋求新的治療方法提供新的思路和理論基礎。

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Expression of per2 gene in CML and its relationship with bcr／abl

LI Jie，YANG Fan，FENG Jian－kai，et al.（The Clinical Laboratorg Yantai Yu－huangding Affiliated Hospital of Qingdao Unlversity，Yantai 264000，China）

Objective This study was aimed to detect the expression of per2and bcr／abl in chronic myeloid leukemia（CML），and to analyze their relationship and potential significance.Methods 30cases of CML patients and 9cases of healthy people control were collected，their expression of per2and bcr／abl were detected by RT－PCR，their relationship was analyzed by correlation analysis.After K562cells were treated with different concentrations of Gleevie，the expression of per2and bcr／abl were detected by RT－PCR.Results We found that per2expression was downregulated in CML patients compared with control，and negative correlated with expression of bcr／abl.Moreover，expression of per2was enhanced in K562cells after treated with Gleevie，accompanied with decreased expression of bcr／abl.Conclusion per2 expression was decreased in CML patients compared with healthy control and negative correlated with bcr／abl expression，which suggested that per2may play an important role in the occurrence and development of CML.

chronic myeloid leukemia；K562cell；per2；bcr／abl

R733.7

A

2014－04－11）

1007－4287（2015）09－1481－03

煙臺市科技發展計劃（2012071）

＊通訊作者，E－mail：zx717＠163.com