血清cf－DNA水平對子宮頸癌患者診斷和生存狀況的判斷價值

馮達紅，王 敏

（1.商洛市商州區人民醫院婦產科，陜西商洛726000；2.中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧沈陽110004）

血清cf－DNA水平對子宮頸癌患者診斷和生存狀況的判斷價值

馮達紅1，王 敏2

（1.商洛市商州區人民醫院婦產科，陜西商洛726000；2.中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧沈陽110004）

目的 探討血清cf－DNA定量檢測在宮頸癌輔助診斷及生存狀況判斷中的價值。方法 分別采集2008年3月至2009年3月我院收治的宮頸癌患者及門診體檢健康婦女各100例的血清。運用熒光定量RT－PCR方法檢測血清cf－DNA含量，采用化學發光法檢測血清中鱗狀細胞癌抗原（SCC）、細胞角蛋白19片段（CYFRA21－1）、糖類抗原125（CA125）、糖類抗原19－9（CA19－9）的含量。結果 宮頸癌患者和健康對照者血清cf－DNA濃度檢測結果分別為134.5（7.9－1721.3ng／ml），18.3（0.32－47.5）ng／ml，宮頸癌患者的cf－DNA明顯高于健康對照組（Z＝－7.324，P＜0.001）。用ROC曲線分析血清cf－DNA濃度對宮頸癌患者的診斷效能，其曲線下面積（0.923），高于傳統指標血清SCC（0.721）、CYFRA21－1（0.734）、CA125（0.652）、CA19－9（0.617）。生存時間＞5年患者的血清cf－DNA濃度明顯低于生存時間＜5年的患者（Z＝6.438，P＜0.001）。結論 血清cf－DNA水平有助于宮頸癌的輔助診斷及預后判斷。血清cf－DNA對宮頸癌的輔助診斷價值要優于傳統腫瘤標志物。

宮頸癌；cf－DNA；腫瘤標記物，生存時間

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1475）

宮頸癌是女性常見的生殖道腫瘤，是女性第二大高發癌癥［1］。早期診斷和及時治療宮頸癌對降低宮頸癌發生率和病死率具有重要的意義。常見的宮頸癌相關腫瘤標志物有鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）、細胞角蛋白19片段（CYFRA21－1）、糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖類抗原19－9（carbohydrate antigen 19－9，CA19－9）［2，3］。近年來外周血游離DNA（cell－free DNA，cf－DNA）已成為檢測多種腫瘤的標志物之一［4－6］。因此我們對2008年3月至2009年3月確診的100例宮頸癌患者的外周血cf－DNA、SCC、CYFRA21－1、CA125和CA19－9水平進行了檢測，分析其與宮頸癌患者的診斷與生存狀況的關系。通過實驗結果來探討血清cf－DNA對宮頸癌診斷和生存狀況的判斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2008年3月至2009年3月于我院婦科住院宮頸癌患者100例，其中鱗癌患者74例，腺癌患者26例。按國際婦產科協會宮頸癌分期標準分期，Ⅰ期62例，年齡32－65歲，平均48.31±8.92歲；Ⅱ－Ⅲ期38例，年齡35－73歲，平均52.95±7.81歲。細胞分級：高分化23例，中分化者47例，低分化者25例，無法分級者5例。診斷均經組織病理學證實，均無其他合并癥。同期門診體檢健康婦女100名，年齡28－62歲，平均43.31±9.24歲。記錄宮頸癌患者的死亡情況，時間截止至2014年3月。

1.2 標本采集 采集研究對象外周靜脈血5ml置于含有分離膠的生化管中，輕輕顛倒混勻4－5次，放置30min，待血液充分凝固后以離心半徑8cm 3 000r／min離心10min，分離血清，置于－20℃冰箱中保存待測。

1.3 血清cf－DNA的測量 （1）血清cf－DNA的抽提：采用上海奇諾腫瘤生物技術公司研制的PAS血清游離DNA抽提試劑，其操作步驟見說明書。（2）EGFR引物［7］：上游引物：5’－CCTGTCATAAGTCTCCTTGTTGAG－3’；下游引物：5’－CAGTCTGTGGGTCTAAGAGCTAATG－3’；（3）熒光定量PCR檢測EGFR胞漿區外顯子28編碼引物序列，取2μL的DNA進行定量PCR檢測，據公式計算出血清游離DNA含量（單位：拷貝數／ml血清）。C＝10×Q／Vext［（公式中C：EGFR拷貝數、Q：CPD（Cytoplasmic Domain）拷貝數、Vext：用于抽提DNA的血清體積（mL）］，再將C按標準曲線轉換得到游離DNA含量（ng／mI）。

1.4 血清SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的檢測 在化學發光儀ARCHITECT i2000（美國雅培公司）上進行檢測，嚴格按照儀器和試劑說明書進行操作，SCC以1.5μg／L為陽性界值，CYFRA21－1以3.3ng／ml為陽性界值，CA125以35U／ml為陽性界值，CA19－9以40U／ml為陽性界值。

1.5 統計方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，cf－DNA及SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的濃度以中位數和四分位數間距表示。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。非正態分布數據采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者與健康對照血清cf－DNA濃度

宮頸癌患者和健康對照者血清cf－DNA濃度檢測結果（以19ng／ml作為陽性臨界值）分別為134.5（7.9－1721.3ng／ml），18.3（0.32－47.5）ng／ml，宮頸癌患者的cf－DNA明顯高于健康對照組（Z＝－7.324，P＜0.001）。

2.2 SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的濃度

采用化學發光法檢測100例宮頸癌患者和100名健康對照者血清SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的含量，見表1。

表1 宮頸癌患者和健康對照者SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的濃度

2.3 各檢測項目對宮頸癌癌診斷價值的比較

血清游離DNA含量和腫瘤標志物SCC、CYFRA21－1、CA125對宮頸癌診斷價值比較，見表2。對宮頸癌患者血清cf－DNA濃度及SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9分別結合健康對照組做ROC曲線，其曲線下的面積（AUC）分別為0.923、0.721、0.734、0.652、0.617。

2.4 宮頸癌患者血清cf－DNA及腫瘤標志物與生存狀況的關系

根據患者治療后生存時間是否＞5年，將100例宮頸癌患者分為兩組，回顧性分析這兩組患者血清cf－DNA及腫瘤標志物，見表3。

表2 各種腫瘤標志物的宮頸癌診斷價值

3 討論

目前中國宮頸癌發病率和病死率處于相當高的水平，2003－2007年宮頸癌發病率為9.62／10萬，同期宮頸癌死亡率為2.54／10萬，在癌癥死亡原因中排列第14位［8］。宮頸癌的早期篩查及診治成為保障女性健康的重要措施之一。積極尋找一種測量方法簡單、創傷小、靈敏度高、特異性好的新型腫瘤標志物對于宮頸癌的早期輔助診斷和治療具有非常重要的意義。宮頸癌相關腫瘤標志物是宮頸癌組織和細胞由于癌基因及其產物的異常表達所產生的抗原和生物活性物質，其對宮頸癌的輔助診斷、估計預后及靶向治療等均具有重要指導意義［9］。但是單項使用腫瘤標志物對早期宮頸癌檢測的靈敏度和特異度均不能滿足臨床需要，常常需要聯合檢測來提高宮頸癌檢測的靈敏度［3，10］。自從1977年Leon等［11］發現在腫瘤患者體內存在cf－DNA之后，血cf－DNA逐漸成為腫瘤標相關志物之一，引起廣泛的關注。本研究通過檢測宮頸癌患者和健康對照者血清cf－DNA含量，我們發現宮頸癌患者的血清cf－DNA水平明顯高于健康對照者（P＜0.001），這一結果說明了血清cf－DNA濃度的升高與宮頸癌的發生密切相關。

臨床上常用來檢測宮頸癌的腫瘤標志物有SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9等［2，9］。SCC是一種特異性高的鱗癌腫瘤標志物，對所有鱗狀上皮細胞起源的癌癥如宮頸癌、食管癌等的診斷及預后判斷有輔助作用［12］。目前研究發現CYFRA21－1在某些惡性腫瘤患者升高，如肺癌、宮頸癌及消化道腫瘤等［13，14］。血清CA125是宮頸癌腺癌常用的篩查指標。CA19－9是大分子量的糖蛋白抗原在各種腺癌中都可升高，特異性較差。本次實驗中宮頸癌患者SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9含量均高于健康對照者，其中，SCC、CYFRA21－1和CA125具有統計學差異（P均＜0.05），CA19－9未見顯著差異。在cf－DNA與SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的ROC曲線下面積及靈敏度、特異度相比較后發現，cf－DNA的ROC曲線下面積（0.923）、靈敏度（81.0%）、特異度（93.0%）及準確性（87.0%）均要高于SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9。

一些研究發現腫瘤標志物的表達高低與癌癥生存時間的關系密切相關［14］。本研究結果發現，生存時間大于5年的宮頸癌患者cf－DNA、SCC與CYFRA21－1的表達均低于生存時間小于5年的患者。因此，這三種腫瘤標志物的表達水平可以初步反映宮頸癌癌患者生存期長短的重要指標，可用作評估患者的生存時間。因此，本研究認為，cf－DNA對宮頸癌的診斷價值要優于傳統的腫瘤標志物SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9。另外cf－DNA與SCC、CYFRA21－1對判斷宮頸癌患者的生存狀況有一定的指導意義。

表3 宮頸癌患者血清cf－DNA及腫瘤標志物與生存狀況的關系

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58（2）：71.

［2］童紅莉，李 娟，溫新宇，等.腫瘤標志物聯合檢測在宮頸癌診斷中的應用價值［J］.標記免疫分析與臨床，2011，（03）：160.

［3］鐘 倩，劉婉敏，蘆雅萍，等.5種腫瘤標志物檢測在卵巢腫瘤的臨床意義［J］.中國實驗診斷學，2010，（06）：876.

［4］BP FOX RK－CG.DNA－based assay for EPHB6expression in breast carcinoma cells as a potential diagnostic test for detecting tumor cells in circulation［J］.Proteomics，2010，7（1）：9.

［5］朱 響，吳 暉，袁愛華，等.血漿游離DNA在惡性腫瘤診療中的應用［J］.國際腫瘤學雜志，2014，41（3）：180.

［6］拜紅霞，戴 洋.血清游離DNA在腫瘤診斷中的研究進展［J］.檢驗醫學與臨床，2011，8（09）：1110.

［7］Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non－small－cell lung cancer to gefitinib［J］.N Engl J Med，2004，350（21）：2129.

［8］李 霓，鄭榮壽，張思維，等.2003－2007年中國宮頸癌發病與死亡分析［J］.中國腫瘤，2012，（11）：801.

［9］徐躍勛，呂錫芳，李文婷，等.宮頸癌腫瘤標志物的研究進展［J］.現代生物醫學進展，2010，（09）：1777.

［10］馬開慧，金 曄，王 煒.四項腫瘤標志物聯合檢測在肺癌輔助診斷中的應用價值［J］.中國實驗診斷學，2013，（12）：2288.

［11］Leon SA，Shapiro B，Sklaroff DM，et al.Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy［J］.Cancer Res，1977，37（3）：646.

［12］Gadducci A，Tana R，Cosio S，et al.The serum assay of tumour markers in the prognostic evaluation，treatment monitoring and follow－up of patients with cervical cancer：a review of the literature［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2008，66（1）：10.

［13］羅 玲，王江紅.支氣管肺泡灌洗液SCCA、CYFRA21－1、CEA聯合檢測在肺癌診斷中的價值［J］.重慶醫科大學學報，2010，（11）：1716.

［14］葉 清，蔣捍東.肺癌患者血清腫瘤標志物水平變化與化療療效及生存時間的相關性［J］.中華肺部疾病雜志（電子版），2013，6（6）：9.

Judgment Value of diagnosis and survival condition of cf－DNA serum level in patients with cervical cancer

FENG Dahong，WANG Min.（Shangluo District People＇s Hospital of Shangluo City，Shangluo 726000，China）

Objective To investigate the quantitative detection of serum cf－DNA in the diagnosis and survival time of cervical cancer.Methods To take serum samples from 100patients diagnosed with cervical cancer and 100healthy controls from March 2008to March 2009in our hospital.Fluorescence quantitative RT－PCR method was used to detect serum cf－DNA content，chemiluminescence was taken to detect the level of serum squamous cell carcinoma antigen（SCC），cytokeratin 19fragment（CYFRA21－1），carbohydrate antigen 125（CA125），sugar antigen 19－9（CA19－9）.Results The concentration of serum cf－DNA in cervical cancer patients and healthy controls were 18.3（0.32－47.5）ng／ml，134.5（7.9－1721.3ng／ml），repectively.The concentration of serum cf－DNA in cervical cancer patients was significantly higher than the control group（Z＝－7.324，P＜0.001）.ROC curves was used to analysis the diagnostic performance of serum cf－DNA in cervical cancer patients with，the area under the curve（0.923）was higher than the traditional serum indicators such as SCC（0.721），CYFRA 21－1（0.734），CA125（0.652），CA19－9（0.617）.Concentration of serum cf－DNA in patients whose survival time was less than 5－year was significantly lower than it in the the patients whose survival time more than 5years（Z＝6.438，P＜0.001）.Conclusion The level of serum cf－DNA may benefit the diagnosis and prognosis of cervical cancer.The aided diagnostic value of serum cf－DNA in cervical cancer was better than conventional tumor markers.

cervical cancer；cf－DNA；tumor markers，survival time

R737.33

A

2014－07－22）

1007－4287（2015）09－1475－03