RhoGDI2與EMT相關蛋白在結直腸癌組織中表達的臨床意義及相關性

陳 穎，姜昊聲，馬俐君，柳思琪，金珍婧，徐 慶

（1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院胃腸外科，上海200127；2.上海交通大學醫學院附屬同仁醫院腫瘤科，上海200336；3.吉林大學第二醫院肝膽胰內科，吉林長春130041）

RhoGDI2與EMT相關蛋白在結直腸癌組織中表達的臨床意義及相關性

陳 穎1，2，姜昊聲2，馬俐君2，柳思琪3，金珍婧3，徐 慶1＊

（1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院胃腸外科，上海200127；2.上海交通大學醫學院附屬同仁醫院腫瘤科，上海200336；3.吉林大學第二醫院肝膽胰內科，吉林長春130041）

目的 探討RhoGDI2與EMT相關蛋白（E－cadherin、Vimentin）在結直腸癌組織中表達的臨床意義以及它們之間的相關性。方法 收集行手術切除且隨訪滿5年的結直腸癌患者組織標本80例。應用免疫組化法檢測標本中RhoGDI2與EMT相關蛋白的表達情況，分析它們與各臨床病理參數間的關系，探討RhoGDI2與EMT相關蛋白間的相關性。結果 RhoGDI2、E－cadherin、Vimentin在結直腸癌組織中的陽性表達率分別為27.5%、23.6%、48.7%。結直腸癌組織中，RhoGDI2的表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期及5年生存率相關（P＜0.05）；E－cadherin的表達與腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期及5年生存率相關（P＜0.05）；Vimentin的表達與腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期及5年生存率相關（P＜0.05）。結直腸癌組織中，RhoGDI2與Vimentin的表達呈正相關（r＝0.295，P＜0.05）；RhoGDI2、Vimentin與E－cadherin的表達呈負相關（r＝－0.278、r＝－0.309，P＜0.05）。結論 RhoGDI2與EMT相關蛋白在結直腸癌組織中的表達密切相關，我們推測RhoGDI2可能通過促進EMT的發生導致了結直腸癌的侵襲、轉移及不良預后。

結直腸癌；RhoGDI2；EMT

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1465）

結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，每年全球新發病例約120萬，死亡病例約60萬［1］。近年來，隨著社會環境及生活模式的改變，結直腸癌在我國的發病率、死亡率呈逐年上升趨勢，已嚴重危害到人民的身體健康［2］。腫瘤的侵襲、轉移是結直腸癌患者預后不良的最主要原因，但其確切的生物學機制目前仍未明確。上皮－間質轉化（epithelial－mesenchymal transi－tion，EMT）是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，與包括結直腸癌在內的惡性腫瘤侵襲、轉移的發生、發展緊密聯系，E－cadherin表達的下降和Vimentin表達的增加是EMT發生的重要標志［3，4］。RhoGDI2屬鳥苷酸解離抑制因子（Rho GDP dissociation inhibitors，RhoGDIs）家族成員之一，具有調節在EMT發生中起著重要作用的RhoGTP酶活性的功能［5，6］。目前有研究發現，RhoGDI2的表達與結直腸癌的侵襲、轉移密切相關［7］。本研究應用免疫組織化學法對RhoGDI2與EMT相關蛋白（E－cadherin、Vimentin）在結直腸癌組織中的表達進行檢測，分析它們與結直腸癌各臨床病理參數間的關系，探討它們之間的相關性，為進一步闡明結直腸癌侵襲、轉移相關生物學機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑

收集80例自2007年1月至2009年1月于上海交通大學醫學院附屬同仁醫院行結直腸癌手術患者的原發癌組織、同期癌旁非癌組織石蠟標本及完整的臨床資料。病理結果均由兩位病理科醫師共同診斷明確。全部病例術前均未行化療、放療及靶向治療。80例患者中男性49例、女性31例；結腸癌57例、直腸癌23例；年齡28－84歲，中位年齡62歲。結直腸癌TNM分期按AJCC2010第七版標準，其中Ⅰ期22例，Ⅱ期17例，Ⅲ期21例，Ⅳ期20例。所有患者自術后起均通過門診或電話隨訪至死亡或存活滿5年。所涉及的標本及臨床資料的獲取均經醫院倫理委員會批準，并得到患者及家屬的知情同意。兔抗人RhoGDI2單克隆抗體購自Abcam公司；鼠抗人E－cadherin、Vimentin單克隆抗體，即用型羊抗兔鼠二抗和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。

1.2 免疫組化法檢測結直腸癌相關組織中RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin蛋白表達

按試劑盒說明書操作。以已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照；鏡下觀察組織細胞形態并拍照。

1.3 免疫組化檢測結果判定

每張切片隨意選取5個光鏡視野（×200），每個視野觀察200個細胞，由2位病理科醫師盲法判讀。計數陽性細胞判斷標準：細胞漿或細胞膜見棕黃色染色顆粒。分級根據陽性細胞范圍及染色強度，按范圍：陽性細胞數低于26%為1分，26%至50%為2分，51%至75%為3分，高于75%為4分；按染色強度：與背景相似為0分，略高于背景為1分，明顯高于背景為2分，深棕黃色強染色為3分。兩組相加后予以分級：0－1分為（－）、2－3分為（＋）、4－5分為（＋＋），6分及以上為（＋＋＋）。分級為（－）、（＋）的定義為陰性，（＋＋）、（＋＋＋）的則定義為陽性。

1.4 統計學處理

應用SAS9.0軟件進行統計學分析，計數資料組間差異采用χ2檢驗進行比較。相關性分析采用Spearman相關分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin在結直腸癌組織及癌旁非癌組織中的表達

免疫組化結果（圖1）提示，陽性細胞呈棕黃色染色，RhoGDI2、Vimentin主要表達于細胞漿，E－cadherin主要表達于細胞漿／膜。在80對配對的組織中，RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin在結直腸癌組織和癌旁非癌組織中的陽性表達率分別為27.5%（22／80）vs5%（4／80）、23.6%（19／80）vs91.2%（73／80）、48.7%（39／80）vs6.3%（5／80），差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 三種標志物在結直腸癌組織及癌旁非癌組織中的表達（DAB，×200）

2.2 RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin在結直腸癌組織中的表達與臨床病理參數的關系

80例結直腸癌組織免疫組化檢測的結果提示，RhoGDI2表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期及5年生存率相關（P＜0.05），與患者的性別、年齡、腫瘤位置、大小及分化程度無關（P＞0.05）；E－cadherin表達與腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期及5年生存率相關（P＜0.05），與患者的性別、年齡、腫瘤位置及遠處轉移無相關（P＞0.05）；Vimentin表達與腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期及5年生存率相關（P＜0.05），與患者的性別、年齡、腫瘤位置及浸潤深度無相關（P＞0.05）（表1）。

2.3 RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin在結直腸癌組織中表達的相關性

22例RhoGDI2陽性表達的結直腸癌患者中，Vimentin陽性表達16例，E－cadherin陽性表達1例；19例E－cadherin陽性表達的結直腸癌患者中，Vimentin陽性表達4例。行Spearman相關性分析顯示，RhoGDI2與Vimentin在結直腸癌組織中的表達呈正相關（r＝0.295，P＜0.05）；RhoGDI2、Vimentin與E－cadherin在結直腸癌組織中的表達呈負相關（r＝－0.278、r＝－0.309，P＜0.05）（表2）。

3 討論

RhoGTP酶是具有GTP酶活性的小分子G蛋白，作為細胞的分子開關控制著眾多信號傳導通路，其生物學活性通過與GDP或GTP結合間的循環來調節，從而起著調控細胞骨架形態、細胞分裂增殖及細胞變形的作用［8］。不同于鳥苷酸交換因子（guaninenucleotide exchanging factors，GEFs）單向激活、GTP酶活化蛋白（GTPase activating proteins，GAPs）單向抑制的功能，鳥苷酸解離抑制因子（guaninenucleotide dissociation inhibitors，RhoGDIs）具有雙向調節RhoGTP酶的作用。RhoGDIs在細胞質中與RhoGTP酶結合后使之處于失活狀態，無法有效結合效應靶蛋白［9］；另一方面，RhoGDIs在細胞膜與活性形式的Rho、Rac1、cdc42相結合，進而抑制GTP酶活化蛋白，避免了RhoGTP酶被水解，使之處于有效的活性狀態［10，11］。相較于龐大的GEFs和GAPs調節因子家族，目前只有3種人RhoGDIs被發現：RhoGDI1、RhoGDI2和RhoGDI3［12－14］。作為RhoGDIs家族中表達最豐富的成員，RhoGDI2最初被發現特異性地表達于造血組織中，由201個氨基酸構成，分子量為27kDa。近年來越來越多的研究發現，RhoGDI2也特異性表達于多種非造血組織腫瘤之中。RhoGDI2在膀胱癌細胞株中的表達與腫瘤細胞的侵襲能力呈反比，RhoGDI2表達的減少與晚期膀胱癌患者的預后不良密切相關，揭示了其可能是一個腫瘤抑制因子［15，16］。另一方面，RhoGDI2在卵巢癌中的表達卻顯著高于卵巢良性腺瘤［17］。此外，RhoGDI2在乳腺癌細胞中呈高表達，具有促進腫瘤細胞體外侵襲、轉移能力的作用［18］。這反映了RhoGDI2也可能是一個腫瘤促進因子。以上的差異也許是RhoGDI2在不同的腫瘤類型或遺傳背景中對RhoGTP酶采取了不同的調控方式所造成的。本研究結果顯示，RhoGDI2在結腸癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁非癌組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結直腸癌患者中，RhoGDI2陽性表達者與陰性表達者相比，具有更深的腫瘤浸潤深度、更高的腫瘤轉移率，更晚的TNM分期以及更低的5年生存率。與Li等［7］的研究相一致，表明了RhoGDI2在結直腸癌中具有促進腫瘤侵襲、轉移及不良預后的作用。

腫瘤發生侵襲、轉移時首先需要打破與周圍細胞間的緊密連接，突破基底膜屏障，侵入周圍間質，然后再進入血液循環，最終定植于遠處器官。近年來，這一系列的變化被認為與上皮－間質轉化（EMT）密切相關［19］。上皮細胞表型蛋白E－cadherin表達的減少，間質細胞表型蛋白Vimentin表達的增加是EMT發生的重要標志。本研究通過免疫組化法發現，E－cadherin在結腸癌組織中的陽性表達率明顯低于癌旁非癌組織。E－cadherin陽性表達的結直腸癌患者具有腫瘤原發病灶較小、分化程度較好、浸潤深度較淺、無淋巴結轉移以及TNM分期較早的臨床病理特點，5年生存率顯著優于陰性表達的患者。Vimentin則與之相反，在結直腸癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁非癌組織，且與結直腸癌患者腫瘤原發灶大、分化程度差、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期晚及5年生存率低密切相關。這反映出結直腸癌侵襲、轉移的機制中確實存在EMT的過程，EMT是導致患者不良預后的重要因素之一。RhoGTP酶可通過ROCK信號轉導通路促進EMT的發生、發展［6］，因此本研究對RhoGTP酶上游蛋白RhoGDI2與下游EMT相關蛋白（E－cadherin、Vimentin）在結直腸癌組織中的表達進行了Spearman相關性分析。結果顯示，RhoGDI2與E－cadherin表達呈負相關，與Vimentin的表達呈正相關，反映了結直腸癌組織中RhoGDI2與EMT相關蛋白間的表達存在一定的相關性。據此我們推測RhoGDI2可能通過對RhoGTP酶的調控促進了腫瘤EMT的發生、發展，誘發了結直腸癌的侵襲、轉移，從而導致了患者不良的預后。

我們的研究表明了RhoGDI2與EMT相關蛋白（E－cadherin、Vimentin）在結直腸癌組織中的表達密切相關，RhoGDI2具有促進結直腸癌侵襲、轉移，導致預后不良的作用，且至少有部分可能是通過參與了腫瘤EMT的過程來實現的。這為我們進一步深入研究RhoGDI2在結直腸癌中的作用機制奠定了基礎。

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Clinical significance and correlation of RhoGDI2 and EMT－related proteins expression in colorectal carcinoma tissues

CHEN Ying，JIANG Hao－sheng，MA Li－jun，et al.（Department of Gastrointestinal Surgery，Renji Hospital，School of medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200127，China）

Objective To investigate the clinical significance and correlation of RhoGDI2and EMT－related proteins（E－cadherin，Vimentin）expression in colorectal carcinoma tissues.Methods The tissue specimens from 80patients that were surgical resected for CRC and follow－up for over 5years.The expression of RhoGDI2and EMT－related proteins（E－cadherin，Vimentin）were assessed by immunohistochemistry.The associations of their expression with clinicopathological parameters and themselves were analyzed.Results The positive expression rate of RhoGDI2，E－cadherin and Vimentin was 27.5%，23.6%，48.7%respectively in CRC tissues.In CRC tissues，the expression of RhoGDI2were associated with the depth of invasion，lymph node metastasis，distant metastasis，TNM stage and 5－year survival（P＜0.05）；the expression of E－cadherin were associated with the tumor size，differentiation，depth of invasion，lymph node metastasis，TNM stage and 5－year survival（P＜0.05）；the expression of Vimentin were associated with the tumor size，differentiation，lymph node metastasis，distant metastasis，TNM stage and 5－year survival（P＜0.05）.The expression of RhoGDI2with Vimentin showed positive correlation（r＝0.295，P＜0.05）；the expression of RhoGDI2，Vimentin with E－cadherin showed negative correlation（r＝－0.278，r＝－0.309，P＜0.05）.Conclusion The expression of RhoGDI2was significantly associated with EMT－related proteins（E－cadherin，Vimentin）in CRC tissues.We speculate that RhoGDI2 may cause CRC invasion，metastasis and poor prognosis by promoting EMT occurrence.

Colorectal Cancer（CRC）；RhoGDI2；EMT

R735.3＋5 R735.3＋7

A

2015－02－25）

1007－4287（2015）09－1465－05

上海市衛計委面上項目（20114194）；吉林省發改委項目（3J113Z583429）；上海市長寧區衛計委面上項目（20114Y02003）

＊通訊作者