多發性骨髓瘤患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達及其臨床意義分析

王麗麗，陳 林，畢桂彬，趙 松，靳風艷，牛 豐＊

（吉林大學白求恩第一醫院1.脊柱外科；2.血液腫瘤科，吉林長春130021）

多發性骨髓瘤患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達及其臨床意義分析

王麗麗1，陳 林1，畢桂彬1，趙 松1，靳風艷2，牛 豐1＊

（吉林大學白求恩第一醫院1.脊柱外科；2.血液腫瘤科，吉林長春130021）

目的 觀察和分析多發性骨髓瘤（MM）患者骨髓液中微小RNA（miRNA）－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達及其臨床意義。方法 選取50例MM患者作為病例組，根據治療效果將其分為初治組（19例）、難治組（18例）和緩解組（13例），選取20例非惡性血液疾病患者作為對照組。對各組患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表達水平和血清β2微球蛋白（β2－MG）水平進行檢測和比較。結果 各組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達水平的差異均有統計學意義（F＝37.839、419.707、445.998，P＜0.05）。其中，難治組患者骨髓液中miRNA－21表達水平顯著高于其他三組，miRNA－15a、miRNA－16表達水平顯著低于其他三組，初治組患者骨髓液中miRNA－21表達水平顯著高于緩解組或對照組，miRNA－15a、miRNA－16表達水平顯著低于緩解組或對照組，以上差異均有統計學意義（P＜0.05）；直線相關分析顯示，MM患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－21表達水平呈正相關關系（r＝0.599，P＜0.05），與miRNA－15a表達水平（r＝－0.829）、miRNA－16表達水平（r＝－0.698）呈負相關關系（P＜0.05），多元線性回歸分析結果顯示，MM患者的血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－15a表達水平呈負相關關系（標化相關系數＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05）。結論 MM患者骨髓液中的miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21表達水平與患者對化療的反應性和腫瘤負荷具有相關性，可用于評價患者病情的進展、預測治療效果和患者的預后。

多發性骨髓瘤；微小RNA；骨髓液；實時PCR；β2微球蛋白

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1461）

微小RNA（miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，可通過抑制特異靶基因的翻譯或直接降解靶基因對基因進行轉錄后調控。有研究結果顯示，miRNA的異常表達可能參與了多發性骨髓瘤（MM）細胞的增殖、分化、凋亡及耐藥等過程，而且某些miRNA可作為MM的有效治療靶點［1］，本研究針對MM患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達及其臨床意義進行了觀察和分析，現將研究的具體情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2014年1月我院收治的MM患者50例作為病例組，均符合MM診斷標準，所有患者均采集骨髓液標本，患者的年齡為42－66歲，平均年齡為（53.8±4.9）歲，男性31例，女性19例。選取20例同期在門診接受骨髓液檢查且最終排除惡性血液病患者作為對照組，年齡為41－63歲，平均年齡為（52.5±4.6）歲，男性12例，女性8例。兩組患者的年齡、性別構成等方面的差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 觀察指標和檢測方法

根據歐洲血液和骨髓移植組（EMBT）對病例組中的非初治患者的療效評價，主要分為完全緩解（CR）、接近完全緩解（nCR）、部分緩解（PR）、微小緩解（MR）、無變化（NC）、病情進展（PD）等幾個等級，并根據是否為初治及治療后的療效，將病例組患者分為初治組（19例）、難治組（18例）、緩解組（13例）。其中，難治組的納入標準為療效未達到PR等級，緩解組的納入標準為療效達到PR及以上。應用實時熒光定量PCR（RT－PCR）法對三組患者及對照組骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達水平進行檢測和比較，miRNA引物設計主要通過查詢Sanger microRNA序列數據庫獲得，對于難以用常規方法設計引物應用頸環結構的反轉錄引物將micoRNA反轉錄成cDNA進行檢測。引物設計如下：miRNA－21：forward primer 5′－GTGCAGGGTCCGAGGT－3′；miRNA－15a：forward primer 5′－CGCCTAGCAGCACATAATGG－ 3′；miRNA－16：forward primer 5′－GCCGTAGCAGCACGTAAATA－3′。

根據擴增曲線和溶解曲線判斷反應質量，以2－△△Ct代表目的miRNA的表達水平，其中Ct值為擴增產物量達到臨界閾值時所對應的循環數；采集病例組患者的清晨空腹外周靜脈血標本，常規離心分離血清后，應用放射免疫法對血清標本中的β2微球蛋白（β2－MG）水平進行檢測和比較。

1.3 統計學分析

本研究所有數據均應用SPSS13.0建立數據庫并進行統計學分析，計量資料應用（均數±標準差）的形式表示，多組之間比較應用單因素方差分析進行處理，兩兩比較應用LSD法進行處理，血清β2－MG水平與骨髓液中三種miRNA表達水平的相關性分析應用Pearson直線相關和多元線性回歸進行處理，以上統計學檢驗均以α＝0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 各組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表達水平的比較

各組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達水平的差異均有統計學意義（F＝37.839、419.707、445.998，P＜0.05），其中，難治組患者骨髓液中miRNA－21表達水平顯著高于其它三組，miRNA－15a、miRNA－16表達水平顯著低于其它三組，初治組患者骨髓液中miRNA－21表達水平顯著高于緩解組或對照組，miRNA－15a、miRNA－16表達水平顯著低于緩解組或對照組，以上差異均有統計學意義（P＜0.05），而緩解組與對照組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 多發性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中三種miRNA表達水平的相關性分析

Pearson直線相關分析顯示，MM患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－21表達水平呈正相關關系（r＝0.599，P＜0.05），與miRNA－15a表達水平（r＝－0.829）、miRNA－16表達水平（r＝－0.698）呈負相關關系（P＜0.05），三種miRNA表達水平與β2－MG水平相關性的散點圖見圖1、圖2、圖3；以血清β2－MG水平為因變量，以骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16的表達水平為自變量，進行多元線性回歸分析，結果顯示，血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－15a表達水平呈負相關關系（標化相關系數＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05），見表2。

表1 各組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表達水平的比較

表2 多發性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中三種miRNA表達水平的相關性分析

3 討論

microRNA是一種內源性非編碼的單鏈小分子RNA，長度約為19－24個核苷酸，可通過與mRNA的3’非翻譯區域（3’UTR）靶向結合、抑制或降解目的mRNA從而對基因的表達發揮調節作用。近年來的研究結果顯示，miRNA參與了細胞的增殖、分化、生長和凋亡等生理過程和多種疾病的病理過程［2］。大量研究證實，異常表達的miRNA是惡性腫瘤發病、進展和轉移的重要調控因子，miRNA可通過多種途徑調節轉錄后因子從而發揮重要的抑癌或致癌作用［3］。目前，學術界已經發現了多種與MM相關的miRNA，其中，主要包括miRNA－15a、miRNA－16、miRNA－34a、miRNA－194－2－192簇、miRNA－18a、miRNA－18b、miRNA－335等，而這些miRNA的表達水平與患者的血清IL－17、IL－21、IL－22、IL－23、IL－27等相關細胞因子水平、ISS分期等均具有相關性［4］，miRNA基因在MM中存在較高的突變率，miRNA19a、miRNA－19b和miRNA335基因突變可能與MM的發病機制有關，而且miRNA基因發生突變的患者的預后更差，因此，針對這些miRNA表達水平進行檢測有助于對MM病程進展和預后進行預測和分析［5］。

圖1 多發性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－21表達水平的相關性

圖2 多發性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－15a表達水平的相關性

圖3 多發性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－16表達水平的相關性

本研究將miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21作為觀察指標，研究結果見表1，這說明MM患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達水平與患者對化療藥物的反應性具有相關性，可用于輔助預測患者的病情轉歸和預后。miRNA－21被認定是miRNA轉錄的主要驅動力，參與了細胞增殖、分化、凋亡，且與腫瘤生長、侵襲、轉移等密切相關，miRNA－21在多種腫瘤組織中異常表達，很多學者主張將外周血中的miRNA－21表達水平作為潛在生物標志物用于腫瘤的診斷、療效評價以及預后預測等方面［6，7］。近年來的研究結果證實，microRNA－21與MM具有密切的相關性，MM患者的循環microRNA－21與其血kappa輕鏈、血lambda輕鏈、血清免疫球蛋白的總量均呈顯著正相關，而與其血清白蛋白水平呈負相關，針對MM患者循環miRNA－21的檢測可以用于反映骨髓瘤細胞的負荷，監測MM的病情進展［8］，而且一些研究者利用成熟miRNA－21的種子序列可通過與其靶mRNA的3’－UTR區完全互補結合發揮負性調節作用這一原理，將miRNA－21作為MM基因治療的靶點［9］。miRNA－15a、miRNA－16是被學術界認為與MM關系密切的miRNA，體外試驗研究結果顯示，MM細胞株可表現為miRNA－15a、miRNA－16表達水平的顯著異常，而經TNF－α預處理的骨髓細胞株H929則可與MM細胞相互作用，通過調節miRNA－15a、miRNA－16表達水平來抑制MM細胞的生長和繁殖［10］，美法侖、硼替佐米等化療藥物均可上調骨髓瘤細胞的miRNA－15a、miRNA－16的表達水平，而IL－6等細胞因子則可抑制骨髓瘤細胞miRNA－15a、miRNA－16的表達［11］。

本研究中的直線相關分析顯示，MM患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－21表達水平呈正相關關系（r＝0.599，P＜0.05），與miRNA－15a表達水平（r＝－0.829）、miRNA－16表達水平（r＝－0.698）呈負相關關系（P＜0.05），多元線性回歸分析結果顯示，MM患者的血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－15a表達水平呈負相關關系（標化相關系數＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05），說明MM患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達水平與患者的血清腫瘤負荷標志物水平具有一定的相關性，可用于評價MM對機體的危害程度，特別是骨髓液中miRNA－15a表達水平的下降是與MM腫瘤負荷的上升相關的獨立危險因素。本研究選取β2－MG作為腫瘤負荷標志物，β2－MG是一種低分子蛋白，由淋巴細胞合成并分泌，主要存在于除紅細胞和胎盤滋養層細胞以外的所有有核細胞中，MM導致的惡性漿細胞過度增殖和積累會導致β2－MG合成和分泌的增加。臨床研究已證實，MM患者的β2－MG水平可出現顯著升高，并且與骨髓瘤細胞的負荷相平行、與腎功能損害程度成正比，因此，β2－MG已被作為一種重要的血清學標志物用于MM早期診斷、療效評價及預后評估［9，12］。

綜上所述，MM患者骨髓液中的miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21表達水平與患者對化療治療的反應性和腫瘤負荷具有相關性，可用于評價患者病情的進展、預測治療效果和患者的預后。

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Analysis on the expression of miRNA－21，miRNA－15a and miRNA－16in marrow liquid of the patients with multiple myelo－ma and its clinical significance

WANG Li－li，CHEN Lin，BI Gui－bin，et al.（Department of Spine Surgery，The First Bethune Hospital of Jilin University，Changchun130021，China）

Objective To observe and analyze the expression of micro RNA（miRNA）－21，miRNA－15aand miRNA－16in marrow liquid of the patients with multiple myeloma（MM）and its clinical significance.Methods 50patients with MM were selected as the case group and divided into the initial treatment group（19cases），the refractory group（18cases）and the remission group（13cases）according to the therapeutic effects.20cases of patients without malignant hematological diseases were selected as the control group.The expression level of miRNA－21，miRNA－15aand miRNA－16in marrow liquid and the serumβ2－microglobulin（β2－MG）level of the patients in all the groups were detected and compared.Results The differences of the expression levels of miRNA－21，miRNA－15a，miRNA－16in marrow liquid of the patients between all the groups were statistically significant（F＝37.839，419.707，445.998，P＜0.05）.The expression level of miRNA－21in marrow liquid of the patients in the refractory group was significantly higher than that in the other three groups，the expression levels of miRNA－15aand miRNA－16were significantly lower than those in the other three groups.The expression level of miRNA－21in marrow liquid of the initial treatment was significantly higher than those in the remission group or the control group，the expression levels of miRNA－15aand miRNA－16were significantly lower than the remission group or the control group.The above differences were statistically significant（P＜0.05）；Linear correlation analysis showed that the serumβ2－MG level in MM patients was positively correlated with the expression level of miRNA－21in marrow liquid（r＝0.599，P＜0.05）level，and negatively correlated with the expression level of miRNA－15a（r＝－0.829），the expression level of miRNA－16（r＝－0.698）in marrow liquid（P＜0.05）.The multiple linear regression analysis showed that the serumβ2－MG level in MM patients was negatively correlated with theexpression level of miRNA－15ain marrow liquid（standardized coefficient＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05）.Conclusion The expression levels of miRNA－15a，miRNA－16and miRNA－21in marrow liquid of patients with MM are correlated with the reactivity of patients to the chemotherapy treatment and the tumor burden，and can be used in evaluation of the progression of the disease and prediction of the effects of the treatment and the prognosis of the patients.

multiple myeloma；micro RNA；marrow liquid；real time PCR；β2microglobulin

R733.3

A

2015－03－22）

1007－4287（2015）09－1461－04

國家自然科學基金面上項目（81471165）

＊通訊作者