抑制自噬增加PI3K／AKT／mTOR信號通路抑制劑引起的胃癌細胞死亡

斯慶圖娜拉，劉 磊

（鄂爾多斯市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000）

抑制自噬增加PI3K／AKT／mTOR信號通路抑制劑引起的胃癌細胞死亡

斯慶圖娜拉，劉 磊＊

（鄂爾多斯市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000）

目的 為了研究3－MA是否可能增強胃癌細胞對PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235的敏感性。方法 以胃癌SNU16細胞系為研究對象，SNU16細胞用不同濃度的NVP－BEZ235（10nM、20nM和50nM）處理24h。實驗分為四組：Control組，20nM NVP－BEZ235組，5mM 3－MA組，20nM NVP－BEZ235聯(lián)合5mM 3－MA組。MTT法用來檢測不同組內(nèi)細胞的生存率，Western blotting用來檢測Cleaved Caspase－3和Cytochrome C的表達水平。結(jié)果MTT結(jié)果表明NVP－BEZ235能抑制SNU16細胞的增殖，3－MA增強了NVP－BEZ235對SNU16細胞的增殖抑制作用。Western blotting結(jié)果表明NVP－BEZ235增加了Cleaved Caspase－3和Cytochrome C的表達，而NVP－BEZ235聯(lián)合3－MA會進一步誘導(dǎo)Cleaved Caspase－3和Cytochrome C蛋白的表達。結(jié)論 3－MA通過抑制自噬增加了SNU16細胞對NVP－BEZ235的敏感性。

胃癌；自噬；NVP－BEZ235；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1457）

盡管最近幾年胃癌的發(fā)病率有所下降，但胃癌在我國惡性腫瘤中仍高居第一位。胃癌的發(fā)病原因主要與地域環(huán)境及日常生活飲食還有幽門螺桿菌感染有關(guān)。目前臨床上治療胃癌的主要手段是化學(xué)療法和手術(shù)治療［1－3］。而分子靶向治療作為新穎的潛在的治療癌癥的手段之一，也在臨床上得到了應(yīng)用。已有實驗研究表明PI3K／mTOR抑制劑NVPBEZ235能抑制胃癌野生型和突變型細胞的增殖并促進其凋亡［4］。腫瘤細胞的生長并非由單一的信號通路所支配，因此同時抑制幾個作用靶點會產(chǎn)生更好的抑制細胞增殖效果［5］。因此本文探討抑制自噬是否可以增加胃癌細胞對PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235的敏感性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 人胃癌細胞株SNU16購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心；胎牛血清（美國HyClone公司）；胰蛋白酶和RPMI1640（美國Gibco公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Amresco公司）；二甲基亞砜DMSO（美國Amresco公司）；3－甲基腺嘌呤（3－methyl adenine，3－MA，德國CALBIOCHEM公司）；NVP－BEZ235（美國Sigma公司）；Cleaved Caspase－3和Cytochrome C抗體（美國proteintech公司）。主要實驗儀器有CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Cabinet公司），BioTek酶聯(lián)免疫檢測儀（Synergy HT公司），Western blot顯像儀（日本Kodak公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株（SNU16）在含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d換液傳代1次。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞毒性試驗檢測 MTT法檢測NVPBEZ235和（或）3－MA作用于胃癌SNU16細胞對其增殖的影響。取對數(shù)生長期SNU16細胞，以8000個／孔接種于96孔培養(yǎng)板，細胞貼壁后加藥，按分組加入NVP－BEZ235或聯(lián)合3－MA作用24h后棄上清，然后每孔加入20μl MTT（5mg／ml）溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4h，即可棄去孔板內(nèi)的液體，再每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO），放于平板振蕩器上振蕩10min，酶標儀檢測每孔光密度（OD）值（570nm波長）。每次實驗重復(fù)3次，取平均值，按公式：細胞抑制率＝1－（藥物組吸光度／對照組吸光度）× 100%，計算各組細胞存活率。

1.2.3Western Blotting檢測 Western Blotting檢測胃癌SNU16細胞中凋亡和線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。①細胞總蛋白的提取：實驗分組，將SNU16細胞接種于培養(yǎng)瓶中給藥作用48小時后，用胰酶消化收集到離心管中，加入預(yù)冷的PBS（1ml），1000rpm／min，室溫離心兩次。取上清轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，混勻后，4℃，3 000rpm／min再次離心。倒凈上清，每管加入200μl－300μl RIPA蛋白裂解液（含1%PMSF），超聲5s左右打碎基因組后4℃放置45min（以上全程冰上操作）。之后用4℃、4 000rpm／min離心，取上清檢測蛋白濃度，按體積比例加入一定量的5Xloading Buffer，98℃煮沸10min使蛋白變性，然后37℃放置10min冷卻處理后存放在－20℃冰箱保存。②采用10%的十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），通過半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后結(jié)合一抗（Cleaved Caspase－3和Cytochrome C工作濃度為1∶1000），第二天加入對應(yīng)的二抗（1∶1000稀釋）室溫孵育2h，洗膜3次，ECL顯色液進行顯影，以β－actin為內(nèi)參照物。提取結(jié)果并用軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組均數(shù)比較用t檢驗，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，采用析因設(shè)計的方差分析來檢驗聯(lián)合效應(yīng)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1NVP－BEZ235可以引起胃癌SNU16細胞死亡

2.1.1MTT檢測不同濃度NVP－BEZ235對SNU16細胞生存率的影響 Control，NVP－BEZ235（NVP）10nM，NVP－BEZ235（NVP）20nM，NVPBEZ235（NVP）50nM作用于SNU16細胞24h，結(jié)果可見不同濃度的NVP－BEZ235可明顯地抑制SNU16細胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性（表1）。

表1　不同濃度NVP－BEZ235對SNU16細胞增殖率的影響

2.1.2Western Blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase－3表達水平的影響 結(jié)果表明NVP－BEZ235能明顯增加SNU16細胞內(nèi)Cleaved Caspase－3的表達（圖1）。

圖1　不同濃度NVP－BEZ235對凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase－3表達的影響

2.1.3Western Blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白細胞色素C（Cytochrome C）表達水平的影響結(jié)果顯示NVP－BEZ235可以明顯的增加SNU16細胞內(nèi)Cytochrome C表達（圖2）。

圖2　不同濃度NVP－BEZ235對Cytochrome C表達的影響

2.2聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3－MA可以明顯增加NVP－BEZ235引起的人膠質(zhì)瘤細胞SNU16細胞凋亡

2.2.1MTT檢測聯(lián)合應(yīng)用3－MA（5mM）對SNU16細胞生存率的影響 實驗分為Control組，3－MA（5mM）組，NVP－BEZ235（NVP，20nM）組，NVP－BEZ235聯(lián)合3－MA（NVP＋3－MA）組，共四組。結(jié)果表明3－MA增強了NVP－BEZ235對SNU16細胞的增殖抑制作用（表2）。

表2　聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3－MA對SNU16細胞增殖率的影響

2.2.2Western Blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase－3表達水平的影響 Western blotting實驗結(jié)果表明Control組和3－MA組幾乎不表達Cleaved Caspase－3；與NVP－BEZ235組相比，NVP－BEZ235聯(lián)合3－MA組能進一步增加Cleaved Caspase－3的表達（圖3）。

圖3　聯(lián)合應(yīng)用3－MA對Cleaved Caspase－3表達的影響

2.2.3Western Blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白細胞色素C（Cytochrome C）表達水平的影響Western blotting實驗結(jié)果表明Control組和3－MA組幾乎不表達Cytochrome C；與NVP－BEZ235組相比，NVP－BEZ235聯(lián)合3－MA組能進一步增加Cytochrome C的表達（圖4）。

圖4　聯(lián)合應(yīng)用3－MA對Cytochrome C表達的影響

3　討論

磷脂酰肌醇3－激酶（PI3K）／蛋白激酶B（AKT）／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路在腫瘤細胞中異常活性，包括胃癌［6］。PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110所組成。一旦PI3K被激活，p110可以使PIP2磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP3，進而通過3－磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1促使AKT的磷酸化。mTOR是PI3K／AKT的下游靶點，可以磷酸化S6核糖體蛋白和真核啟動因子4E結(jié)合蛋白1，進而調(diào)控腫瘤細胞生長和增殖［7］。雙重PI3K－mTOR抑制劑可以有效地抑制AKT的活性，因為傳統(tǒng)的mTORC1抑制劑（比如雷帕霉素）可以導(dǎo)致PI3K信號通路的反饋激活，而雙重抑制劑可以通過綁定這些激酶的ATP結(jié)合槽進而抑制PI3K和下游的mTOR激酶的活性，此外雙重抑制劑還可以抑制AKT、S6核糖體蛋白和4E結(jié)合蛋白的活性。NVPBEZ235是一種新穎的雙重PI3K－mTOR抑制劑，臨床前期動物模型的試驗表明NVP－BEZ235可以抑制腫瘤的增長，NVP－BEZ235在實體瘤中的治療效果目前正在第1／2臨床試驗中進行評估［8，9］。在本實驗中，我們驗證了NVP－BEZ235能抑制胃癌細胞SNU16的增殖，并促進其凋亡。接下來，我們探討抑制自噬是否更能促進NVP－BEZ235抑制增殖和促進凋亡的效果。

自噬是細胞在溶酶體內(nèi)降解自身衰老、損傷的細胞器或蛋白并降解其內(nèi)容物的過程。自噬在機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細胞生長發(fā)育和蛋白質(zhì)合成方面都發(fā)揮著重要的作用［10］。通過自噬降解的產(chǎn)物，細胞可以產(chǎn)生能量、生成新的蛋白質(zhì)和細胞膜。在饑餓或應(yīng)激狀態(tài)下，自噬通過提供能量源或維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)促進細胞存活。

自噬在癌癥中具有雙重作用：其一，自噬可以通過自噬性細胞死亡抑制腫瘤的發(fā)生；其二，自噬也可以通過為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和防止刺激物對細胞的破壞維持腫瘤的生長。但以后者為主［11］。3－甲基腺嘌呤（3－MA）通過抑制Ⅰ型和Ⅲ型PI3K，阻斷了自噬泡和溶酶體的融合，進而抑制了自噬［12］。在我們的研究中，抑制自噬增加了NVP－BEZ235對SNU16細胞的增殖抑制作用和促凋亡作用，同時進一步增加了Cleaved Caspase－3和Cytochrome C蛋白的表達。

總之，我們對胃癌的研究表明雙重PI3K／mTOR抑制劑BEZ235和（或）聯(lián)合自噬抑制劑3－ MA都可以誘導(dǎo)凋亡。BEZ235和3－MA聯(lián)合使用會有更好的促進SNU16細胞凋亡的效果。因此，這些結(jié)果為臨床上雙重PI3K／mTOR抑制劑聯(lián)合3－MA治療胃癌提供了實驗基礎(chǔ)。

［1］Taghizadeh－Kermani A，Emadi－Torghabeh A，Taraz－Jamshidi S.A report of a rare gastric cancer case：leptomeningeal carcinomatosis［J］.Iran J Cancer Prev，2015，8（1）：60.

［2］Yeldan E，Oguz S，Usta U，et al.Gastric cáncer：Overview［J］.Colomb Med（Cali），2013，44（3）：192.

［3］Yeldan E，Oguz S，Usta U，et al.Risk factors for peritoneal dissemination of gastric cancer［J］.Minerva Chir，2015，70（2）：91.

［4］Mueller A，Bachmann E，Linnig M，et al.Selective PI3Kinhibition by BKM120and BEZ235alone or in combination with chemotherapy in wild－type and mutated human gastrointestinal cancer cell lines［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2012，69（6）：1601.

［5］Mandal CC，Rahman MM.Targeting Intracellular Cholesterol is a Novel Therapeutic Strategy for Cancer Treatment［J］.J Cancer Sci Ther，2014，6（12）：510.

［6］Mukherjee B，Tomimatsu N，Amancherla K，et al.The dual PI3K／mTOR inhibitor NVP－BEZ235is a potent inhibitor of ATM－and DNA－PKCs－mediated DNA damageresponses［J］.Neoplasia，2012，14（1）：34.

［7］Sarbassov DD，Guertin DA，Ali SM，et al.Phosphorylation and regulation of Akt／PKB by the rictor－mTOR complex［J］.Science，2005，307（5712）：1098.

［8］Maira SM，Stauffer F，Brueggen J，et al.Identification and characterization of NVP－BEZ235，a new orally available dual phosphatidylinositol 3－kinase／mammalian target of rapamycin inhibitor with potent in vivo antitumor activity［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（7）：1851.

［9］Wu P，Hu YZ.PI3K／Akt／mTOR pathway inhibitors in cancer：a perspective on clinical progress［J］.Curr Med Chem，2010，7（35）：4326.

［10］Joshua D.Rabinowitz，Eileen White.Autophagy and Metabolism［J］.Science，2010，330（6009）：1344.

［11］Xu DW，Zhang GQ，Wang ZW，et al.Autophagy in tumorigenesis and cancer treatment［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（6）：2167.

［12］Klionsky DJ，Codogno P，Cuervo AM，et al.A comprehensive glossary of autophagy－related molecules and processes［J］.Autophagy，2010，6（4）：438.

The experimental research of 3－MA in the enhancement of sensitivity to PI3K／AKT／mTOR pathway inhibitor of gastric cancer in vitro

Siqingtunala，LIU Lei.（Erdos City Center Hospital，Erdos 017000，China）

Objective To study whether 3－MA can enhance the sensitivity of inhibitor NVP－BEZ235to gastric cancer cell.Methods SNU16cells were treated by different coneentrations of NVP－BEZ235（10nM，20nM and 50nM）for 24h.Next，SNU16cells were divided into four groups：Control group，20nM NVP－BEZ235group，5mM 3－MA group，20nM NVP－BEZ235combined with 5mM 3－MA group.MTT assay was used to examine the proliferation inhibition ofSNU16cells.Western blotting was used to detect a change in protein level of Cleaved Caspase－3and Cytochrome C.Results MTT assay showed that growth inhibition rates among the groups with different levels of NVP－BEZ235was statistically significant.NVP－BEZ235combined with 3－MA enhanced the inhibition ratio of cell compared with NVPBEZ235group.Western blotting showed that Cleaved Caspase－3and Cytochrome C were increased in cells following treated with NVP－BEZ235，and then 3－MA enhanced the expression of these proteins induced by NVP－BEZ235.Conclusion 3－MA sensitized SNU16cells to NVP－BEZ235by inhibition of auto－phagy.

gastric cancer；autophagy；NVP－BEZ235；apoptosis

R735.2

A

斯慶圖娜拉（1979－），女，蒙古族，鄂爾多斯市中心醫(yī)院，博士學(xué)歷，研究方向：消化內(nèi)科學(xué)。

2014－10－16）

1007－4287（2015）09－1457－04

＊通訊作者