Syndecan1慢病毒干涉質粒的構建及其對舌鱗癌CAL27細胞增殖的影響

王曉峰，孔晨飛，王 偉，張天夫＊

（吉林大學中日聯誼醫院1.口腔科；2.科學研究中心，吉林長春130033）

Syndecan1慢病毒干涉質粒的構建及其對舌鱗癌CAL27細胞增殖的影響

王曉峰1，孔晨飛2，王 偉1，張天夫1＊

（吉林大學中日聯誼醫院1.口腔科；2.科學研究中心，吉林長春130033）

目的 探討RNA干擾Syndecan1基因對舌鱗癌CAL27細胞增殖的影響，闡明其作用機制。方法 構建靶向基因Syndecan1的siRNA載體重組質粒pDSL－hpUGIP－Syndecan1－1834、pDSL－hpUGIP－Syndecan1－1588、pDSL－hpUGIP－Syndecan1－544作為RNA干擾質粒組，同時設立陰性對照質粒組（pDSL－hpUGIP－control siRNA質粒）；采用熒光定量PCR檢測Syndecan1mRNA的表達水平和表達抑制率；采用細胞計數法檢測CAL27細胞的增殖率。結果 倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞感染率為90%。熒光定量PCR檢測，RNA干擾組Syndecan1mRNA表達水平低于陰性對照組（P＜0.01），平均抑制率為68.6%。細胞增殖率檢測，與陰性對照組比較，RNA干擾質粒組細胞增殖率明顯升高（P＜0.01）。結論 干擾Syndecan1可抑制該基因的轉錄，并促進CAL27細胞的增殖。

Syndecan1基因；舌鱗癌；CAL27細胞；RNA干擾

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1447）

口腔鱗狀細胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤。舌鱗狀細胞癌是最常見的口腔鱗癌類型，由于其手術范圍相對局限，腫瘤易發生侵襲、轉移，導致舌鱗癌易復發，預后不良［1］。Syndecan1是硫酸類肝素蛋白聚糖家族（Heparin－sulphateproteoglyeans，HsPGs）的syndecans亞家族成員之一。Syndecan 1在多種上皮性腫瘤細胞表面均有表達，是腫瘤細胞與腫瘤微環境成分之間交流中的橋梁，在腫瘤細胞分化、增殖、侵襲轉移及血管生成過程中發揮重要作用［2］。

我們構建了Syndecan1干涉慢病毒載體，轉染舌鱗癌CAL27細胞，觀察了Syndecan1siRNA質粒在CAL27細胞中的表達情況，為進一步探討Syndecan1基因在舌鱗癌發生、發展中的作用及機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 RNAiso Plus提取試劑盒、PCR試劑盒、PCR產物凝膠回收試劑盒購買于TaKaRa公司；感受態細菌購自天根公司；質粒小提試劑盒購買于Axygen公司；BamHI和XhoI限制性內切酶、T4連接酶購自NEB公司；反轉錄試劑盒購自Promega公司；DMEM培養基購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量染料購自大連TaKaRa寶生物工程有限公司；CAL27細胞、慢病毒表達載體四質粒系統包括載體質粒Entry載體pEN＿hH1c、包裝質粒pMD，pAX及Destination載體pDSL＿hpUGIP為本實驗室留存。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒干涉質粒的構建 用TE buffer稀釋互補的寡核苷酸鏈，使其終濃度為50μmol／L；將干涉片段進行退火：分別吸取25μl（50μl體系）溶解好的成對干涉片段于PCR管中，混勻，95℃水浴5分鐘，關閉水浴自然降溫至室溫，使互補的寡核苷酸鏈退火；將退火后的寡核苷酸鏈插入Entry載體，轉化連接子，測序；將測序正確的Entry clone與Destination載體進行同源重組（重組體系：Entry clone：50－150ng；Destination vector（150ng／μl）：1 μl；LR ClonaseTMII enzyme mix：2μl；TE buffer，pH8.0：補足至10μl）。

將重組體系置于25℃水浴中1h；加入1μl Proteinase K，于37℃10min終止反應；將重組質粒轉化感受態Stb13，挑取單克隆，進行測序。

1.2.2 慢病毒包裝和感染 將人胚腎細胞293T接種于6cm細胞培養板中，溫箱培養20h細胞貼壁后匯合度達到80%－90%可進行轉染；用LipofectamineTM2000轉染試劑將含有目的基因的慢病毒質粒與包裝質粒psPAX2和pMD2.G按照4∶3∶1比例，8μg體系DNA轉染293T細胞；8h后更換新鮮培養基；分別于48h、72h和96h收集病毒上清液并用0.45μm濾膜過濾；將過濾后病毒上清約15ml放入50ml超濾管，4℃，4 500rpm離心0.5－1h濃縮病毒，可收集病毒濃縮液約200μl；將50μl病毒濃縮液、8μg／ml聚凝胺與相應的細胞培養基混合，侵染目的細胞；6－8h后，更換新鮮的完全培養基，基因干涉情況可在病毒侵染后48h后對目的細胞進行檢測。

1.2.3 反轉錄 使用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑盒提取哺乳動物細胞總RNA。反轉錄使用Promega公司的ImProm－IITMReverse Transcription System試劑盒（A3800）進行。

1.2.4 Real－time PCR實驗 PCR實驗采用兩步法進行，反應條件為95℃60s，95℃15s和60℃60s，反應45個循環。反應中使用的DNA染料為帶有熒光染料的PCR反應預混合物SYBR Green Realtime PCR Master Mix。所得結果的Cp值（threshold cycle）為達到超出熒光信號的檢測閾值時所需的循環數。所得數據用2－ΔΔCp方法來計。Syndecan1上游引物序列：5’－AGGACGAAGGCAGCTACTCCT－3’，下游引物序列：5’－TTTGGTGGGCTTCTGGTAGG－3’，β－actin，上游引物：5’－TGACGTGGACATCCGCAAAG－3’，下游引物序列：5’－CTGGAAGGTGGACAGCGAGG－3’。

1.2.5 細胞增殖能力檢測 1.0×105細胞接種于35mm皿中。每24h胰酶消化細胞并計數。分析實驗結果并繪制生長曲線。

1.2.6 統計學分析 用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。Syndecan1基因mRNA表達水平、細胞增殖數以±s表示，組間比較采取單因素方差分析。

2 結果

2.1 重組質粒瞬時轉染293FT細胞的轉染效率 倒置熒光顯微鏡觀察轉染后的細胞，可觀察到細胞帶有綠色熒光（圖1），表明重組的質粒成功轉入了293FT包裝細胞中。收集細胞培養液，感染CAL27細胞，倒置熒光顯微鏡觀察并細胞計數，計算感染效率為90%，表明重組的質粒成功轉入CAL27細胞中（圖2）。

2.2 Syndecan1慢病毒干涉質粒的驗證 如圖3所示，RNA干擾質粒組Syndecan1mRNA表達抑制率分別為67.6%、58.4%和79.9%，平均抑制率為68.6%。

圖1 轉染慢病毒質粒的293FT細胞

圖2 感染慢病毒的CAL27細胞

2.3 干涉Syndecan1促進CAL27細胞增殖 以各組CAL27細胞增殖數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪制生長曲線（圖4）。培養72h后，Syndecan1RNA干擾質粒組CAL27細胞生長速度均明顯高于對照組。

圖4 細胞增殖率數

3 討論

有文獻報道，Syndecan 1表達下降或缺失與結直腸癌的組織低分化和臨床分期高［3］、皮膚基底細胞癌強侵襲性［4］、肝內膽管細胞癌的不良預后［5］等多項因素有關。上述研究表明，Syndecan1在多種惡性腫瘤中均有異常表達，能夠調節正常細胞及多種腫瘤細胞凋亡、增殖或細胞周期功能。但在舌鱗癌發生、發展中的作用及具體分子機制的研究尚處于空白階段。

本實驗利用siRNA技術構建了Syndecan1siRNA慢病毒質粒，成功干擾CAL27細胞中Syndecan1mRNA的表達水平，使得細胞增殖率明顯增加，初步發現了Syndecan1基因對舌鱗癌細胞的影響。

本項研究中構建了pDSL－hpUGIP－Syndecan1重組慢病毒表達載體，用慢病毒重組質粒及空載體陰性對照分別感染舌鱗癌CAL27細胞，在熒光顯微鏡下觀察，感染細胞均呈明顯綠色熒光。運用RT－PCR實驗對干涉質粒的干涉效果進行驗證。通過MTT實驗檢測了干擾Syndecan1后細胞的增殖情況，發現敲除內源Syndecan1后，舌鱗癌細胞的增殖能力明顯增強。這一結果提示我們Syndecan1可能在舌鱗癌的發生發展中發揮著抑癌作用。

［1］Greenlee RT.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2001，51（1）：15.

［2］BartlettAH，HayashidaK，ParkPW.Molecular and cellular mechanisms of syndecans in tissue injury and inflammation［J］.Mol Cells，2007，24（2）：153.

［3］Lundin M，Nordling S，Lundin J，et al.Epithelial syndecan 1expression is associated with stage and grade in colorectal cancer［J］.Oncology，2005，68（4－6）：306.

［4］Bayer－Gamer IB，Dilday B，Sanderson RD，et al.Syndcean 1expression is decreased with increasing aggressiveness of basal cell careinoma［J］.Am J Dermato Pathol，2000，22：119.

［5］Harada K，Masuda S，Hirano M，et al.Reduced expression of syndcean－1correlates with histologic dedifferentiation，lymph node metastasis，and poor prognosis in inirahepatic cholangioeareinoma［J］.Hum Pathol，2003，34（9）：857.

Effect of RNA interference of Syndecan1 gene on proliferation of tongue squamous carcinoma CAL27 cells

WANG Xiaofeng，KONG Chen－fei，WANG Wei，et al.（Department of Stomatology，China－Janpan Union Hospital，Jilin University，Chanchun130033，China）

Objective To investigate the effect of RNA interference of Syndecan1gene on the cell proliferation of tongue squamous carcinoma CAL27cells，and to elucidate the mechanism.Methods Three siRNA plasmids targeting human Syndecan1gene，including pDSL－hpUGIP－Syndecan1－1834、pDSL－hpUGIP－Syndecan1－1588and pDSL－hpUGIP－Syndecan1－544，were constructed and regarded as RNA interference plasmid grous.pDSL－hpUGIP－control siRNA plasmid was regarded as negative control.RT－PCR was used to detect the expression of Syndecan1mRNA and the inhibitory rates of CAL27cells was evaluated.Results The infection rate of cells was 90%under inverted fluorescence microscope；the RT－PCR results showed that the levels of Syndecan1mRNA in RNA interference plasmid grous were lower than those in negative control group（P＜0.01），and the average inhibitory rate was 68.6%.Compared with negative control，the proliferation rates of CAL27cells in RNA interference plasmid grous were increased（P＜0.01）.Conclusion Interference of Syndecan1gene might inhibit the transcription of the gene and further increase the proloferation of CAL27cells.

Syndecan1gene；tongue squamous carcinoma；CAL27cells；RNA interference

R739.86

A

2014－11－26）

1007－4287（2015）09－1447－03

吉林省科技廳自然科學基金課題（2012150780）

＊通訊作者