穩定表達miR-17-5p的PC12細胞株構建及鑒定

張皓云, 王魯娟, 王鳳斌, 劉紅兵, 蘇文霞

(1. 濰坊醫學院 基礎醫學概論教研室, 山東 濰坊 261053; 2. 濰坊醫學院 診斷學教研室, 山東 濰坊 261053;3. 濰坊醫學院 生理學教研室, 山東 濰坊 261053)

張皓云1, 王魯娟2, 王鳳斌3, 劉紅兵3, 蘇文霞3

(1. 濰坊醫學院 基礎醫學概論教研室, 山東 濰坊 261053; 2. 濰坊醫學院 診斷學教研室, 山東 濰坊 261053;3. 濰坊醫學院 生理學教研室, 山東 濰坊 261053)

目的:構建穩定表達miR-17-5p 的PC12細胞株。方法:將質粒PEGFP-N1-vector空載體和PEGFP-N1-miR-17-5p表達載體擴增、抽提,利用脂質體轉染技術將質粒轉染PC12細胞,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白GFP表達,Real-time PCR檢測轉染PC12細胞 miR-17-5p的表達。結果:熒光顯微鏡觀察到空載組和miR-17-5p組細胞都有綠色熒光蛋白高表達,Real-time PCR檢測穩定轉染miR 17-5p后PC12細胞內miR-17-5p的表達較空載組明顯升高(P<0.01)。 結論:miR-17-5p在PC12細胞穩定表達,為進一步研究miR-17-5p對神經細胞的調制作用提供有用的細胞模型。

微小RNA； miR-17-5p； PC12細胞

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是細胞分化、生長、增殖、衰老以及凋亡的重要調節因子[1],在腦組織中可調節多種基因的表達,廣泛參與神經元發育、細胞成熟和遷移、突觸可塑性等多種生理過程,是學習和記憶過程中重要的調控因子。越來越多的研究表明，miRNA的功能異常可能參與了阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的發生。miR-17-5p是miR-17-92基因簇的一員,已有多篇文獻報道miR-17-5p可能通過調控細胞周期、凋亡、炎癥反應和免疫應答等參與腫瘤的發生、侵入和轉移等[2-3]。目前,有研究顯示miR-17-5p在神經組織有特異性表達,但其對神經細胞結構和功能的調節作用研究較少,為此我們構建穩定表達miR-17-5p的PC12細胞株,為研究miR-17-5p在神經細胞的調制作用構建良好的細胞模型。

1 實驗材料與試劑

PC12細胞(中國科學院上海生命科學研究院)；質粒PEGFP-N1-vector空載體(vector)和PEGFP-N1-miR-17-5p(miR-17-5p)表達載體(加拿大多倫多大學楊伯華教授饋贈)；XL-1-blue感受態菌(濰坊醫學院分子免疫實驗室保存)；RPMI-1640培養基(HyClone,賽默飛世爾科技有限公司)、胰蛋白酶(杭州四季青生物材料工程有限公司)；胎牛血清(上海依科賽生物制品有限公司)；D0018質粒中量抽提試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；Lipofectamine 2000(invitrogen公司)；Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quatitation Assay試劑盒(上海吉瑪公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

PC12細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中,37℃、5%的CO2的培養箱中培養,每隔48 h換液,待單層培養細胞生長至80%～90%融合后傳代,選取對數生長期細胞進行實驗。

2.2 質粒的擴增、抽提

(1) 質粒的擴增。將紙片上的質粒vector(526 μg/mL)和miR-17-5p (266 μg/mL)剪下,加入TE緩沖液(pH8.8)100 μL,4 ℃靜置約2 h,離心1 min,留上清液備用:取100 μL的XL-1-blue感受態菌,再加入20 μL質粒上清液混均；冰浴30 min左右；42 ℃熱擊90 s；置于冰上5 min,加入LB培養基600 μL；37 ℃搖床1 h；離心2 min,棄上清液450 μL,保留沉淀物150 μL備用,接種到已備好的卡那抗性培養基上；第2天挑出單個菌落加入5 mL卡那LB； 37 ℃搖床過夜。

(2) 質粒抽提。采用碧云天D0018中量抽提試劑盒按說明書,抽提質粒miR-17-5p。用紫外-可見光分光光度計(NanoDrop 2000c,賽默飛世爾科技有限公司)檢測質粒濃度。

2.3 細胞株的構建

(1) 細胞準備。選取對數生長期的PC12細胞并接種于6孔細胞培養板中,待細胞長至90%～95%混合時,吸出完全培養基,用RPMI-1640(不含血清)沖洗2～3次,加入適量RPMI-1640(不含血清)。

(2) 細胞轉染與篩選。利用Lipofectamine 2000脂質體,將抽提所得vector、miR-17-5p質粒轉染到PC12細胞中,G418(600 μg/mL)篩選2周,挑取GFP陽性單克隆細胞,以300 μg/mL G418完全培養基進行擴增培養,備用。熒光倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態變化。

2.4 熒光顯微鏡觀察轉染的綠色熒光蛋白的表達

將穩定轉染后細胞傳代,接種入放有10%的多聚賴氨酸處理后蓋玻片的24孔板中,待細胞貼壁培養24 h后取出, PBS漂洗3次,4%的多聚甲醛4 ℃固定30 min,取出細胞爬片,封片,熒光顯微鏡下觀察細胞形態和綠色熒光蛋白的表達。

2.5 Real-time PCR檢測 miR-17-5p的表達

細胞總 RNA 提取按Trizol說明書進行,經紫外-可見光分光光度計檢測,A260∶A280值為1.8～2.0(A為吸光度)的用于cDNA合成。采用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quatitation Assay試劑盒(上海吉瑪公司產品)進行 RNA 反轉錄、miR-17-5p real-time PCR 擴增,具體操作按照說明書進行。U6 為內參照基因。反應條件:95 ℃、3 min；95 ℃、12 s,62 ℃、60 s 40個循環。根據相對定量法計算目的片段擴增比例,各樣本重復3 次。所得數據用 2-ΔΔCt評定各組穩轉細胞株內 miR-17-5p相對表達量。

2.6 數據統計分析

3 結果

3.1 vector、miR-17-5p轉染PC12細胞及G418抗性克隆的篩選

用Lipofectamine 2000脂質體包裹質粒vector、miR-17-5p后對PC12細胞進行轉染, 600 μg/mL G418進行抗性克隆的篩選。G418的培養液中培養至14 d,未轉染細胞無G418抗性，不能貼壁生長,轉染后細胞有細胞克隆生長。

3.2 熒光顯微鏡觀察轉染的綠色熒光蛋白的表達

2組細胞在熒光顯微鏡下均可見到強弱不等的綠色熒光(見圖1),vector組細胞綠色熒光表達亮度高,分裂增殖能力強,細胞密度高、輪廓清楚；miR-17-5p組細胞較vector組綠色熒光表達稍弱,分裂增殖能力差，細胞密度低、部分細胞輪廓不清楚。

圖1 Fluorescent microscopy of vector and miR-17-5p stable transfected PC12 cells (× 100).

3.3 Real-time PCR檢測穩定轉染后各組細胞內 miR-17-5p的表達

PC12細胞穩定轉染 miR-17-5p表達載體后,細胞內 miR-17-5p的表達較vector空載組明顯升高(P<0. 01),見圖2。

圖2 The expression of miR-17-5p in stable transfected PC12 cells. Each bar represents the mean±S.E.M. of four independent experiments. **P<0.01, compared with vector.

4 討論

miRNAs是一類長度為20～25個核苷酸分子組成的內源性非編碼小分子RNA,通過與靶mRNA分子3’端非編碼區域( 3’ -untranslated region,3’-UTR) 的完全或不完全配對,降解靶基因mRNA或抑制蛋白合成,從而調節靶基因參與的信號通路,實現對細胞增殖、凋亡、分化、新陳代謝等的調節。研究證明，人類60% 以上的蛋白編碼基因表達受到miRNA 調控[4]。腦組織中富含miRNA,相對于其他器官表達的miRNA種類更多,表達水平也更高,在正常的神經系統中,miRNA參與了不同生理過程、不同信號傳導通路的基因表達調控,如神經系統的發育、神經元增殖、凋亡、突觸可塑性、樹突棘形成、神經保護及誘導神經干細胞分化等[5-7],miRNA與大腦的學習與記憶功能以及神經變性性疾病等都密切相關[8]。隨著年齡的老化及細胞分裂的進行,機體miRNA的合成、代謝及功能也有可能會發生一系列的變化,而對這一過程的深入了解將有助于miRNA在AD等神經退行性疾病發生、發展的探討。

AD是一種以進行性認知功能障礙、記憶損害為主要表現的中樞神經系統退行性疾病。研究發現AD的發生機制可能與β淀粉樣蛋白 (β-amyloid protein,Aβ)沉積、Tau蛋白磷酸化、免疫炎癥等病理過程有關。miRNA能通過介導這些病理過程而參與AD的發生[9-10]。APP基因的點突變、代謝異常及過表達引起的Aβ聚集,APP也是miRNA靶向調控分子之一,據數據庫預測分析,APP mRNA 3’UTR 區存在多個miRNA的潛在結合位點,篩選與AD相關的miRNAs及其靶基因和相應的蛋白表達,有望成為研究AD發病機制和治療的新途徑。

研究顯示，miR-17-5p在腦組織有特異性表達,參與調控神經元APP基因表達的過程,在膠質細胞瘤的研究中發現miR-17-5p通過抑制murine double minute 2 (MDM2)基因的表達,抑制腫瘤細胞的增殖和降低耐藥性[11-13]。PC12細胞株源自神經嵴細胞,經神經生長因子誘導處理后,可分化成交感神經元樣細胞,這種分化使其在形態、生理、生化功能方面更接近于神經元。我們利用轉基因技術,成功建立了在PC12細胞內過表達miR-17-5p的細胞模型,熒光顯微鏡下觀察發現miR-17-5p組PC12細胞生長緩慢、細胞密度低,提示miR-17-5p對細胞的分裂、增殖可能有抑制作用。

我們將深入研究和探討miR-17-5p對神經細胞的調制作用及其機制,從新的角度來研究AD的發病機制,從而為其治療提供新的靶點。

References)

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Establishment and appraisal of miR-17-5p stably transfected PC12 cell line

Zhang Haoyun1, Wang Lujuan2, Wang Fengbin3, Liu Hongbing3, Sun Wenxia3

(1. Department of preclinical medicine, Weifang Medical College, Weifang 261053, China; 2. Department of diagnostics, Weifang Medical College, Weifang 261053, China; 3. Department of Physiology, Weifang Medical College, Weifang 261053, China)

Objective: To establish stable expressing miR-17-5p PC12 cell line.Methods: Amplification and extraction of PEGFP-N1-vector and PEGFP-N1-miR-17-5p plasmids. Then the plasmids were transfected into PC12 cells by Lipofectamine 2000. Fluorescence microscope and real-time PCR were employed to detect the expression alterations of GFP and miR-17-5p in stable transfected PC12 cells. Results: High expressions of GFP were observed both in vector group and miR-17-5p group. Real-time PCR show that the expression of miR-17-5p is significantly elevated in PEGFP-N1-miR-17-5p stable transfected PC12 cells compared with the PEGFP-N1-vector stable transfected cells (P<0.01). Conclusion: Stable transfection of miR-17-5p PC12 cell line is established which will provide a useful tool to study the role of miR-17-5p in neurons.

microRNA; miR-17-5p; PC12 cell

2015- 05- 11 修改日期：2015- 06- 23

山東省自然科學基金資助項目(ZL2013HL065);山東省高等學校科技計劃項目(J15LK10)

張皓云(1974—)，女，北京，博士，講師，研究方向為神經退行性疾病機制及其防治研究.

E-mail：haoyunzh@163.com

R33-33,Q4-33

B

1002-4956(2015)12- 0066- 03