CCR-2在膠質瘤血管生成中的作用機制研究*

丁山

膠質瘤是人體血管化程度最高的腫瘤，其具有高復發率的臨床特點，新生的血管不僅為腫瘤的生長提供營養支持，還構成了腫瘤侵襲的途徑，單核細胞趨化因子MCP-1是CC趨化因子超家族重要成員，在腫瘤細胞中可高表達MCP-1及其受體CCR-2[1]。研究表明小膠質細胞及巨噬細胞中CCR-2表達升高[2]。本研究提出膠質瘤細胞可能通過MCP-1/CCR-2途徑改變膠質瘤血管生成的微環境，參與膠質瘤細胞侵襲，從而更好的解釋CCR-2在膠質瘤血管生成中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞與儀器 試劑：膠質瘤細胞系N9細胞（中國科學院細胞庫），含血清的完全培養基及不含血清培養基（美國GIBCO公司），PCR試劑盒（上海碩盟生物），免疫組化試劑盒（武漢博士德），HRP標記山羊抗小鼠IgG，HRP標記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物），含EDTA的胰酶（美國GIBCO公司），一抗：VEGF、IL-8兔單克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG（美國Santa Cruz公司）。儀器：細胞培養超凈臺（蘇州凈化），培養箱（美國Queue systems），倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯），高轉速冷凍離心機（德國BiofugeStratos），-80℃ -4 ℃冰箱（日本松下），高壓消毒箱（美國Tuttnauer），轉膜儀及電泳儀（美國伯樂公司），PCR儀（澳大利亞Rotor-gene）。

1.2 細胞培養與傳代 膠質瘤細胞系N9細胞培養于含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養基中，置于5% CO2、37 ℃孵箱中傳代培養。當細胞密度達到4×106以上的時候進行傳代，清洗培養基后，用含0.02% EDTA的胰蛋白酶進行細胞消化，倒置顯微鏡觀察細胞回縮即終止消化，加入同體積的有血清培養基，吹打，5 min 10 000 r/min離心，棄上清，取細胞懸液，計數后接種到新的培養瓶中。

1.3 CCR2活化 待細胞貼壁生長至4×106，對照組細胞用常規培養基，觀察組運用MCP-1處理細胞，50 ng/mL MCP-1分別于0、12、24、36、48 h誘導活化，提取培養上清用于檢測VEGF、IL-8蛋白分泌情況，細胞用于提取RNA，以分析VEGF、IL-8 mRNA的表達。

1.4 免疫組化方法 采用SP檢測法，加入3%過氧化氫封閉阻斷內源性過氧化物酶，50 μL非免疫動物血清封閉，加50 μL VEGF、IL-8一抗過夜，50 μL生物素標記第二抗體，辣根過氧化物酶孵育，DBA顯色，蘇木素復染，中性樹膠固封。結果判定：陽性細胞為細胞胞漿胞膜在倒置顯微鏡下出現深棕黃色的染色。

1.5 RT-PCR（半定量逆轉錄聚合酶鏈反應）方法 提取總RNA。取2 μg總RNA行逆轉錄cDNA，取20 μL作為反應體系。PCR反應由逆轉錄產物2 μ以及18sRNA和VEGF、IL-8的引物共同組成。反應過程按照標準的RT-PCR步驟進行：首先預變性的反應條件為95 ℃、5 mins，接著進行梯度變性反應，共進行30次的循環。接著對所得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過拍攝電泳圖像對所得到的電泳結果進行凝膠成像分析系統分析。內參選擇18sRNA作為參照，同樣完成以上PCR系統的成像，對得到的半定量結果進行對比分析，通過量化的吸光度積分值進行分析（A值）。

1.6 Western blotting方法 提取上清蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉膜，加VEGF、IL-8一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶1000）37 ℃孵育1 h。ECL光化學法顯色，用彩色圖像分析系統測定吸光度。

1.7 統計學處理 所有采集的數據使用SPSS 21.0統計軟件進行分析。其中對符合正態分布資料的數據采用（±s）表示，對非正態分布數據采用中位數和四分位數間距來表示。遵循正態分布而且方差齊性，兩兩比較采用LSD檢驗。非參數檢驗法對不同時間所表達的mRNA的量和蛋白的量進行比較，應用Kruskal-wallis H檢驗進行多組間數據的比較，應用Mann-whitney U檢驗法進行數據比較，具有統計學差異的以P<0.05表示。

2 結果

2.1 免疫組化法檢測CCR-2在膠質瘤細胞系N9細胞中表達情況 取5張片，每張片取5個視野，取平均值。陽性表達以細胞核著色為主，其陽性細胞數評分：<5%計為0分，6%~25%計為1分，26%~50%計為2分，51%~75%計為3分，>75%計為4分；染色的著色評分：不著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最后的結果評判陽性率和著色的強弱相加之和為總得分，0分的計為陰性組“-”，1~2分的計為弱陽性組“+”，3~4分的計為陽性組“++”，5~7分的計為強陽性組“+++”。CCR-2在膠質瘤細胞系N9細胞中有較高的陽性表達，共46個細胞，-4個，+15個，++17個，+++10個，占91.30%。

2.2 RT-PCR檢 測MCP-1活 化CCR2后VEGF和IL-8mRNA表達水平 經過活化之后可以增加N9細胞的VEGF和IL-8mRNA表達水平，與未活化組相比差異具有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 通過Western blot法檢測MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8的蛋白表達水平 經過活化之后可以增加N9細胞的VEGF和IL-8蛋白表達水平，與未活化組比較差異具有統計學意義（P<0.05），見表2。

表1 RT-PCR檢測MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8mRNA表達水平（x-±s）

表2 Western blot法檢測MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8的蛋白表達水平（x-±s）

3 討論

膠質瘤是人體血管瘤中一種復發率較高的腫瘤，以新生血管的快速增長為主要病理特征，新生血管不僅給腫瘤提供營養支持還可以構成腫瘤外周組織侵襲的途徑[3]。單核細胞趨化蛋白1-MCP-1是CC趨化因子超家族的主要成員，其受體為CCR2。已有研究表明兩者與腫瘤細胞浸潤有著密切的關系[4]。膠質瘤患者的腦脊液中存在MCP-1及CCR2的高表達，過表達CCR2還存在于膠質瘤祖細胞中，因此本研究通過探討單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）受體CCR-2在膠質瘤血管生成中的作用，為更好的研究其在腫瘤復發中的機制。

血管的生成在腫瘤的轉移、侵襲中發揮著重要的作用，但是其始動細胞一直是腫瘤血管生成的關鍵科學問題[5]。VEGF和IL-8是兩種重要的促進血管生成因子，可直接刺激內皮細胞表面的受體，發揮內皮細胞生成、增殖及遷移的作用[6]。本研究結果顯示，CCR-2在膠質瘤細胞系N9細胞中有較高的陽性表達，經過活化之后可以增加N9細胞的VEGF和IL-8mRNA及蛋白表達水平，與未活化組相比差異具有統計學意義。研究提示，膠質瘤細胞中CCR2活化可以促進血管內皮因子及白細胞介素-8的表達，進而具有促進血管生成的作用。膠質瘤形成是CCR2通過MCP-1活化發揮血管生成作用的。

綜上所述，膠質瘤的生成中促血管生成因子之間的調控是關鍵因素，在今后的抗腫瘤藥物研發方面應將促血管生成因子考慮到其中，更有效地抑制血管地生成，更好地發揮對腫瘤生長發展和遷移的抑制作用。

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