PDGF/ROCK通路介導的肌成纖維細胞分化在大鼠矽肺形成中的作用*

張麗娟 李倩 鄧海靜 張文麗 王小君 裴鑫 郝小惠 李治國楊方

在矽肺形成過程中，被激活的內(nèi)皮細胞、吞噬二氧化硅的肺泡巨噬細胞等可釋放大量的細胞因子（包括轉(zhuǎn)化生長因子-β、血小板源性生長因子等）。轉(zhuǎn)化生長因子-β，血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）在矽肺病患者血清中的含量明顯升高[1]。肌成纖維細胞是一種超微結(jié)構(gòu)和生理功能介于平滑肌細胞和成纖維細胞之間的高度分化型細胞，特異性表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），具有很強的分泌細胞外基質(zhì)及收縮的功能[2-3]。那么，PDGF能否通過誘導肌成纖維細胞的分化而發(fā)揮促矽肺纖維化作用，尚未見文獻報道。這將是本研究將要探討的內(nèi)容之一。研究表明，PDGF受體-β（PDGFR-β）與配體PDGF結(jié)合后，可促使肌動蛋白重排，發(fā)揮促有絲分裂、趨化等生理作用，但其具體作用機制仍有待進一步研究[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil-forming protien kinase，ROCK）可通過控制細胞骨架肌動蛋白的排列和細胞收縮調(diào)節(jié)細胞的黏附、遷徙、增殖和凋亡，在器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。以上研究結(jié)果提示ROCK通路可能在PDGF促進矽肺纖維化過程中發(fā)揮著重要作用。因此本研究又進一步探討了ROCK通路是否參與了PDGF誘導肌成纖維細胞的分化過程從而在矽肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康成年雄性 Wistar大鼠40只，體重（180±10）g（北京維通利華動物技術(shù)有限公司），于河北聯(lián)合大學實驗動物中心屏障實驗室飼養(yǎng)（溫度20~26 ℃，濕度50%~70%，晝夜交替，自由飲食進水）。

1.2 材料與試劑 標準α石英粉塵（中國疾病預防控制中心）；兔抗大鼠α-SMA、ROCK、phospho-PDGFR-β多克隆抗體（美國Epitomics公司）；小鼠抗大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原單克隆抗體（美國 Sigma公司）；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒、BCIP/NBT顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 矽肺動物模型建立 將動物隨機分為四組，每組10只，乙醚麻醉后采用非暴露式氣管插管，按照實驗分組支氣管內(nèi)一次性灌注生理鹽水或濃度為50 g/L的生理鹽水SiO2混懸液。（1）模型對照4周組：支氣管內(nèi)灌注滅菌生理鹽水1.0 mL/只，腹腔內(nèi)埋入注入生理鹽水的微量藥物釋放泵，4周后處死；（2）模型對照8周組：同模型對照4周組處理后于8周后處死；（3）矽肺模型4周組：支氣管內(nèi)灌注SiO2混懸液1.0 mL/只，腹腔內(nèi)埋入注入生理鹽水的微量藥物釋放泵，4周后處死；（4）矽肺模型8周組：同矽肺模型4周組處理后于8周后處死。各組動物腹主動脈采血后處死取肺組織并進行形態(tài)學觀察，右下葉肺組織經(jīng)多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋以備免疫組織化學染色，其余肺組織迅速凍于液氮中保存以備Western blot檢測[8]。

1.3.2 Western blot法檢測大鼠肺組織內(nèi)α-SMA、phospho-PDGFR-β、ROCK以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達 按照文獻[9]的方法提取并測定蛋白濃度后，90 μg/孔上樣，SDSPAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。采用5%的牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h，一抗（phospho-PDGFR-β抗體、Ⅰ型、Ⅲ型膠原抗體1∶1 000稀釋；α-SMA抗體、ROCK抗體、GAPDH抗體1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜；二抗（1：3 000稀釋）37 ℃孵育1 h；堿性磷酸酶顯色。用圖像掃描后以Image J軟件對蛋白表達條帶進行吸光度（A）值的定量分析，目的蛋白條帶A值經(jīng)內(nèi)參平衡后，以各組與模型對照4周組的比值作為蛋白相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料均以（±s）形式描述，進行完全隨機設(shè)計的單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀 模型對照組雙肺表面光滑，呈粉紅色，彈性良好。矽肺模型組雙肺顏色蒼白，質(zhì)地變硬，雙肺表面可見散在灰白色結(jié)節(jié)，分布較均勻。矽肺模型4周組與模型對照組相比，雙肺體積增大。而矽肺模型8周組與矽肺模型對照4周組相比，雙肺體積縮小。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織注：A：模型對照4周組；B：模型對照8周組；C：矽肺模型4周組；D：矽肺模型8周組

2.2 phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA蛋白在肺組織中表達的變化 與模型對照組比較，矽肺模型組phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA蛋白表達增強，其中矽肺模型4周組phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA蛋白表達分別為模型對照4周組的3.89倍、2.46倍和1.53倍，矽肺模型8周組phospho-PDGFR-β、ROCK蛋白表達強度分別為模型對照8周組的3.81倍、2.07倍和1.48倍，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、圖2。

2.3 肺組織內(nèi)Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達 與模型對照組比較，矽肺模型組的Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達增強，其中矽肺模型4周組Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達灰度值（OD值）為分別為模型對照4周組的1.73倍1.99倍，矽肺模型8周組Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達強度分別為模型對照8周組的1.97倍和2.02 倍。見表1、圖2。

表1 大鼠肺組織內(nèi)phospho-PDGFR-β、Rock、α-SMA、Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白的表達（x-±s）

3 討論

圖2 大鼠肺組織內(nèi)phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達

目前塵肺病是我國最嚴重的職業(yè)病，2013年塵肺病報告病例數(shù)占職業(yè)病報告總例數(shù)的87.72%，給國家、社會和群眾健康帶來了極大的危害[10-12]。然而，在塵肺病的治療方面，目前尚無特效方法。因此，探索塵肺病發(fā)病的分子機制以延緩或阻斷肺纖維化的發(fā)展進程，仍具有重要的實際意義。在矽肺形成過程中，吞噬二氧化硅的肺泡巨噬細胞可釋放大量細胞因子（包括TGF-β，PDGF等），其中TGF-β/Smad促進肌成纖維細胞（myofibroblast）轉(zhuǎn)化構(gòu)成了器官纖維化發(fā)病過程中一個較為明確的機制[13-15]。

本研究中，筆者對肺纖維化過程中另一重要的促纖維化因子-PDGF在矽肺纖維化中的中的作用及其機制進行了進一步的探討。研究中，筆者采用非暴露式氣管二氧化硅混懸液灌注法制備大鼠矽肺模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)矽肺模型組大鼠雙肺顏色蒼白，質(zhì)地變硬，雙肺表面可見散在灰白色結(jié)節(jié)。矽肺模4周組與模型對照組相比，雙肺體積增大。而矽肺模型8周組與矽肺模型對照4周組相比，雙肺體積縮小。表明灌注SiO2粉塵4周后，矽肺模型大鼠肺內(nèi)已經(jīng)形成明顯的硅結(jié)節(jié)伴有彌漫性間質(zhì)纖維化，染塵后8周，模型大鼠肺纖維化程度進一步加重，這符合矽肺的發(fā)生、發(fā)展特征，表明大鼠矽肺模型制備成功。研究中筆者還進一步觀察了phospho-PDGFR-β、ROCK、α-SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白在矽肺模型大鼠肺組織中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與相應模型對照組比較，矽肺模型組phospho-PDGFR-β、ROCK蛋白表達增強的同時，α-SMA蛋白表達增強，而肌成纖維細胞特異性表達α-SMA，提示PDGF/ROCK信號通路在肌成纖維細胞分化過程中可能發(fā)揮了重要作用。此外，與相應模型對照組比較，矽肺模型組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達也明顯增強，而Ⅰ型、Ⅲ型膠原是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的主要成分之一，因此Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達的增加也是肺纖維化的重要病理特征—細胞外基質(zhì)過度沉積的重要表現(xiàn)。以上研究結(jié)果提示，PDGF可能通過激活ROCK信號轉(zhuǎn)導通路促進大鼠肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，進而促進矽肺大鼠肺組織內(nèi)膠原的合成，從而在肺纖維化形成過程中發(fā)揮了重要作用。

肺纖維化是一個復雜的病理生理過程的結(jié)局，是復雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)相互作用導致細胞外基質(zhì)合成與降解的動態(tài)平衡被打破的結(jié)果，因此，對于PDGF/ROCK通路是否在促進膠原合成的同時也影響了膠原的降解，以及不同的細胞因子在矽肺纖維化形成過程中的相互作用仍將需進一步研究探討。

[1]姚武，馮斐斐，焦?jié)?，?TGF-B1、PDGF、CTGF在塵肺病患者血清中的表達水平變化及意義[J].四川大學學報（醫(yī)學版），2006，30（5）：754-756.

[2]Fausther M，Dranoff J A.Integrins myofibroblasts，and organ fibrosis[J].Hepatology，2014，60（2）：756-758.

[3]孫艷，劉君，鄧愛軍.1-磷酸鞘氨醇對體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞α-SMA表達的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2010，7（20）：6-7.

[4]李代洪，艾俊濤，謝欣，等.血小板衍生生長因子受體 （PDGFR）抑制劑的研究進展[J].腫瘤藥學，2013，3（1）：2-6.

[5]Singh V，Jaini R，Torricelli A A，et al.TGFβ and PDGF-B signaling blockade inhibits myofibroblast development from both bone marrowderived and keratocyte-derived precursor cells in vivo[J].Exp Eye Res，2014，121：35-40.

[6]柳飛，付平.RhoA/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶信號通路與慢性腎臟疾病[J].華西醫(yī)學，2011，26（5）：781-783.

[7]Hu Y B，Li X，Liang G N，et al.Roles of Rho/Rock signaling pathway in silica-induced epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells[J].Biomed Environ Sci，2013，26（7）：571-576.

[8]閆靜波，張麗娟，李倩，等.N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸抗大鼠矽肺纖維化的實驗研究[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2008，26（7）：401-405.

[9]楊方，吉子言，李丹丹，等.TGF-β1介導 Smad通路調(diào)節(jié)在大鼠矽肺纖維化形成中的作用[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2011，38（23）：4930-4932.

[10]中國疾病預防控制中心.2013年全國職業(yè)病報告情況報告 .http：//www.chinacdc.cn/mtdx/cn/mtdx/wdwsdxgbd/201407/t20140701_98951.htm.2014-07-01.

[11]林玲，王晶，段曉靜.104例矽肺合并癥的臨床分析[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（24）：133-134.

[12]李永斌.50例高齡矽肺患者肺通氣功能及病情分析[J].中外醫(yī)學研究，2011，9（26）：40-41.

[13]Park I H，Park S J，Cho J S，et al.Effect of simvastatin on transforming growth factor beta-1-induced myofibroblast differentiation and collagen production in nasal polyp-derived fibroblasts[J].Am J Rhinol Allergy，2012，26（1）：7-11.

[14]于天水，官大威，馬勇，等.肌成纖維細胞在纖維化疾病中的研究進展[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2013，2（2）：167-171.

[15]Manickam N，Patel M，Griendling K K，et al.RhoA/Rho kinase mediates TGF-β1-induced kidney myofibroblast activation through Poldip2/Nox4-derived reactive oxygen species[J].Am J Physiol Renal Physiol，2014，307（2）：159-171.