動脈留置針在大鼠體腦組織灌注中的應用*

韋曉勇 陸波 閔紅星 王毅 李軍

免疫組化等病理學實驗研究中，為避免腦組織細胞的變形及自溶現象，動物處死前需行灌注固定處理[1-2]，故動物在體腦組織的灌注固定效果對試驗結果尤為重要。就腦組織灌注固定方面，報道的文獻不少，有經心臟灌注、頸總動脈灌注、經股動脈灌注等方法；灌注過程中有夾閉腹主動脈、胸主動脈等；灌注針有用靜脈輸液器針、自制灌流針（去掉輸液器針頭的針尖或12-16號針頭上套一長約1.5 cm的塑料管并將塑料管前端剪成針尖狀）和普通針頭等。對此，為尋求一種操作簡單易行且灌注固定效果好的方法，筆者在大鼠體腦組織的灌注固定實驗過程中，采用動脈留置針夾閉胸主動脈經心臟灌注的方法，現將實驗操作過程的體會介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和器械 BD動脈留置針（貨號：REF682245，規格型號：20 G、1.10 mm× 45 mm、49 mL/min），見圖1，4%多聚甲醛新鮮配置（天津市光復精細化工研究所），0.9%復方氯化鈉注射液（500 mL/4.5 g、寧夏啟元藥業），10%水合氯醛（成都金山化學試劑有限公司），三通（舒爾康、批號：120225）、止血鉗、組織剪、眼科剪、小動脈夾、皮鑷、輸液管（2副）等。

圖1 BD動脈留置針

1.2 實驗動物 選取體重450~500 g，健康雄性18個月齡SD大鼠24只[購于寧夏醫科大學動物實驗中心，清潔級，合格證號：SCXK（寧）2011-0001]，常規條件下飼養，自由飲水，普通飲食。

1.3 實驗方法 將灌注所用的0.9%復方氯化鈉注射液加熱至37 ℃[3]、新鮮配置4%多聚甲醛濾去雜質[3]、輸液管（兩副輸液管用三通連接好）、手術器械等物品準備就緒后，放置盛有上述0.9%復方氯化鈉和4%多聚甲醛的輸液瓶距離操作臺1.5 m高的位置[4]。雄性SD大鼠經10%水合氯醛（0.4 mL/100 mg）麻醉，待大鼠反正反射消失后，將其仰臥位于實驗臺上，固定頭部和四肢，暴露胸部，沿胸骨中線自劍突向上依次剪開皮膚和胸骨，充分暴露胸腔，顯露心臟和主動脈弓，迅速用皮鑷提起左側肺，可見其下位于大鼠脊柱左側的胸主動脈（ 胸主動脈右側為食管）[5]，以小動脈夾夾閉胸主動脈。并迅速用眼科剪剪開心包，用動脈留置針在心尖波動最明顯處進針，進入約0.5 cm時，右手往外退針芯，同時左手持針翼將套管自左側心室推送至升主動脈直至套管針尾部，此時，關閉套管針尾端的開關，防止血液外溢，連接輸液管，剪破右心耳，打開套管尾端和輸液管開關，灌注0.9%復方氯化鈉注射液，先快后慢，待自右心耳流出液體顏色清亮，此時旋轉三通開關，由快及慢灌注4%多聚甲醛，待大鼠頸部及上肢僵硬，說明灌注固定成功[6]。隨后斷頭取腦，之后將腦組織置于4%多聚甲醛固定4 ℃保存[7]。

1.4 觀察指標 （1）觀察并記錄灌注后大鼠組織的色澤、質感及是否含有血絲。（2）觀察并記錄實驗中所用的0.9%復方氯化鈉注射液和4%多聚甲醛的量、灌注插管時間、總灌注時間。灌注插管時間是指從針進入心尖開始至插管成功所用時間，總灌注時間是從針進入心尖開始至灌注固定成功所用時間。（3）觀察并記錄灌注過程中大鼠頸部、胡須、四肢和尾巴是否抽搐。（4）觀察并記錄灌注過程中是否發生肺循環灌注。發生肺循環途徑灌注的現象時鼻腔中會有灌流液流出[8]。（5）觀察并記錄在灌注插管過程中損傷血管、穿破心腔和灌注過程中套管脫出等不良事件的發生率。

2 結果

灌注后大鼠腦組織呈乳白色，質地較硬，且未含血絲（圖2）。實驗中所用的0.9%復方氯化鈉注射液和4%多聚甲醛的量分別為（107±9.2）mL、（175±17.3）mL，灌注插管時間和總灌注時間分別為（10±1.8）s、（41±4.1）min。灌注過程中大鼠頸部、胡須、上肢明顯抽搐，下肢及尾巴未抽搐。灌注過程中均未發現大鼠鼻腔中有灌流液流出，故未發生肺循環灌注。灌注插管過程中未出現損傷血管、穿破心腔和灌注過程中套管脫出等不良事件。

圖2 灌注后大鼠腦組織

3 討論

免疫組化等病理學實驗研究中需對組織進行定性、定位或定量研究。因此，在組織切片之前，需對組織進行灌注固定，因為固定好的組織能抑制細胞內溶酶體酶的釋放和活性， 防止自溶；抑制組織中細菌的繁殖，防止組織腐敗，使細胞的蛋白質、脂肪、糖等各種成分凝固成不溶性物質，以防止物質擴散，維持原有組織的形態結構[9]。大鼠在體腦灌注過程中，通過大鼠天然的循環系統直接進行灌注固定，固定液可快速、均勻地分布到腦組織各個部位，所以腦組織標本制備多采用此法[10-11]。

灌注固定主要堅持兩個原則：一要盡量保持活體的狀態；二要盡量行動迅速從而避免動物長時間處于痛苦和瀕死狀態，引起病理假象，從而干擾科研結果[12]。目前，據文獻[12]報道，小動物灌注多采用經心臟灌注方法，而經頸總動脈因操作難度大，費時而逐漸被淘汰。腦組織灌注過程中為節省灌注液，依研究報道有夾閉腹主動脈、胸主動脈等[5]，但夾閉腹主動脈需進行開腹，增加操作難度，延長灌注總時間，降低實驗效率。灌注針是保證整個灌注過程的必要條件，因此，灌注針的選擇對整個灌注過程尤為重要。有研究報道灌注針可用靜脈輸液器針[8]、自制灌流針[5，13-14]和普通針頭[14]等，這些灌注針雖可進行灌注，但都有各自弊端。如靜脈輸液器針和普通針頭因針尖鋒利，在插管過程中可刺破心臟及心室，且易脫出，使灌注失敗或發生肺循環灌注。而自制的灌流針[5，13]，一般因針尖鈍圓，不易刺入心臟，需借助眼科剪[12]，又因心臟跳動，增加眼科剪的操作難度，在心尖處剪的口可能過大或過小，也可能剪破心臟，影響灌注固定效果，而通過剪口，插入灌注針，動作要輕慢[5]，從而延長灌注時間甚至導致灌注失敗。陳浩宇等[14]自制的灌注針因塑料前端成針尖狀，在灌注插管時可損傷血管及心腔，并可能引起肺循環灌注。

因此，筆者采用動脈留置針夾閉胸主動脈經心臟灌注的方法，可避免上述弊端，且依據許曉泉等[15]研究，在灌注開始時加熱至37 ℃的0.9%復方氯化鈉注射液的速度要快，能更好地排出腦組織內的血流，灌注新鮮配置濾去雜質的4%多聚甲醛時速度需放慢，讓多聚甲醛在腦組織內停留更長的時間，以便有效固定。本實驗結果表明：灌注過程中大鼠頸部、胡須、上肢明顯抽搐，下肢及尾巴未抽搐，說明完全夾閉胸主動脈，可節省灌注液；另外，灌注過程中未發生肺循環灌注，保證了體循環灌注的效果，進而灌注后大鼠腦組織呈乳白色，未見血絲，且質地較硬；灌注插管時間僅用了（10±1.8）s，可見操作簡單且節約時間；灌注插管過程中未出現損傷血管、穿破心腔和灌注過程中套管針脫出等不良事件，保證了灌注過程順利進行，且可節約實驗成本。

本研究的創新點：采用動脈留置針為灌注針，在整個灌注過程中，發現采用動脈留置針具有以下優勢：（1）進針易：動脈留置針芯針尖鋒利，心尖處進針容易，進針約0.5 cm時退出針芯，將套管從左心室順利推送至升主動脈，可節約灌注插管時間；（2）出血少：動脈留置針套管的外徑較針芯大[16]，可完全占據心尖穿刺點，減少出血；（3）損傷小：在退出針芯推送套管過程中，由于套管頂端鈍圓，可避免損傷心腔及升主動脈；（4）推送順：動脈留置針套管原料采用聚四氟乙烯，管壁硬度適宜、光滑，可順利推送至升主動脈；（5）明插管：在動脈套管推送過程中，可看到套管進入升主動脈的全過程，確保插管成功，同時可避免肺循環灌注的發生；（6）易固定：套管尾端兩側有針翼，較其他灌注針容易固定；（7）難脫出：動脈套管長度45 mm，插管成果后，套管很難脫出，有利于灌注的順利進行；（8）速度可：動脈留置針套管管腔直徑1.10 mm，流量49 mL/min，可保證灌注速度，強化灌注效果，節約灌注時間和灌注液。

綜上所述，本實驗操作簡單，灌注插管迅速、損傷小，可避免肺循環灌注，總個灌注過程省時、省液，且灌注固定效果好，值得推廣應用。

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