MMP-9、TIMP-1的表達與糖尿病合并肺結(jié)核發(fā)病的關(guān)系探討*

陳健兒 吳文斌 郭健

糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌性疾病，而糖尿病患者患肺結(jié)核的幾率是正常人群的3~4倍，兩者之間互相影響，肺結(jié)核合并糖尿病患者常因營養(yǎng)代謝障礙、機體免疫力低下，易發(fā)生各種感染，使原已穩(wěn)定的結(jié)核病灶重新活動。目前對糖尿病合并肺結(jié)核的研究多是關(guān)于血漿中各細胞因子的表達水平，而很大可能是細胞外基質(zhì)的過度積累造成的，MMP-9是人體中藥的基質(zhì)金屬蛋白酶，TIMP-1是其特異性抑制因子，兩者的動態(tài)平衡對細胞外基質(zhì)的含量有關(guān)鍵的作用，對糖尿病合并肺結(jié)核病的病因有較為密切的關(guān)系[1]。本研究探討肺部病變基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及組織金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）在不同程度的糖尿病合并肺結(jié)核病中的表達水平，旨在發(fā)現(xiàn)病因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年12月-2014年12月在本院治療的患者152例，其中A組60例為肺結(jié)核合并糖尿病患者，男28例，女32例，平均年齡（43.9±7.3）歲，肺結(jié)核確診依據(jù)胸片及胸部CT或者痰菌培養(yǎng)陽性 ，糖尿病確診依據(jù)空腹血糖、尿糖及糖耐量實驗確診；B組47例為肺結(jié)核非糖尿病患者，男23例，女24例，平均年齡（45.0±8.1）歲，肺結(jié)核合并糖尿病根據(jù)其病史、胸部X線檢查、痰菌檢查確診；C組45例為對照組，無肺部病變，無其他器質(zhì)性病變，男21例，女24例，平均年齡（46.0±7.8）歲。三組患者的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。經(jīng)本院倫理委員會批準，納入的所有患者均簽署知情同意書后留取肺部組織。保留的肺組織10%甲醛溶液固定48 h，待免疫組化法測定。

1.2 診斷與排除標準 （1）診斷標準：肺結(jié)核診斷均由病理證實。2型糖尿病診斷標準按2010年ADA糖尿病診斷標準：①糖化血紅蛋白A1c≥6.5%；或②血糖FPG≥7.0 mmol/L。空腹定義為至少8 h內(nèi)無熱量攝入；或③口服糖耐量試驗時2 h血糖≥11.1 mmol/L；或④在伴有典型的高血糖或高血糖危象癥狀的患者，隨機血糖≥11.1 mmol/L。而在無明確高血糖時，應(yīng)通過重復(fù)檢測來證實標準①~③。（2）排除標準：合并免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病，心、腎功能衰竭，支氣管結(jié)核，腫瘤；人免疫缺陷病毒陽性；近期應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑。

1.3 方法 采用免疫組化方法測定腎臟組織TIMP-1、MMP-9。選擇TIMP-1、MMP-9兔抗人多克隆抗體作為檢測抗體，MMP-9測定時組織無需處理，TIMP-1組織進行抗原熱修復(fù)。新鮮配制的3% H2O2去離子水孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS（0.01 mol/L，pH 7.25~7.35）沖洗2 min，3次。滴加MMP-9，37 ℃孵育1~2 h，PBS沖洗2 min，3 次。滴加兔IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗2 min，3次，選用DAB顯色，蒸餾水充分沖洗，用中性樹膠封固，空白對照采用PBS代替一抗[2-4]。結(jié)果判斷：顯微鏡下觀察各組中HE染色后的組織結(jié)構(gòu)，觀察免疫組化反應(yīng)的定位、分布及染色強度，每張切片陽性細胞的著色為棕黃色和棕褐色，并且陽性細胞數(shù)>5%認為陽性表達。每例均設(shè)有HE切片作對照觀察，并設(shè)陽性和陰性對照，用IPP 6.0（Image pro plus 6.0）分析圖片，計算平均光密度（Average optical density，AOD）值。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20.0進行分析，計量資料以（±s）表示，比較采用F檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)核活動性比較 A組的活動性肺結(jié)核患者27例（45.0%），非活動性結(jié)核患者33例（55.0%）；B組的活動性肺結(jié)核患者12例（25.5%），非活動性結(jié)核患者35例（74.5%）。A組活動性肺結(jié)核患者的比率較肺結(jié)核非糖尿病組高，說明肺結(jié)核合并糖尿病可能是肺結(jié)核活動性的影響因素。兩組患者中活動性及非活動性患者比較，肺結(jié)核的活動度差異存在統(tǒng)計學意義（字2=4.312，P<0.05）。

2.2 三組患者MMP-9及TIMP-1蛋白表達比較 三組患者MMP-9及TIMP-1蛋白表達進行統(tǒng)計學比較，發(fā)現(xiàn)A組患者MMP-9及TIMP-1蛋白表達水平較B組和C組患者的高，B組患者的較C組患者高，且A組患者的MMP-9/TIMP-1的值較B組高，B組的較C組高。說明MMP-9和TIMP-1蛋白的表達在患者組較正常組高，而A、B組的比值中糖尿病患者組的MMP-9/TIMP-1更高，見表1。

表1 三組患者MMP-9及TIMP-1蛋白表達IOD值的結(jié)果分析

2.3 不同活動性肺結(jié)核患者MMP-9及TIMP-1蛋白表達的比較 活動性肺結(jié)核患者MMP-9及MMP-9/TIMP-1的蛋白的表達值比非活動性肺結(jié)核患者高，而活動性肺結(jié)核患者TIMP-1蛋白的表達卻比非活動性肺結(jié)核患者的低，差異均有統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 不同活動性肺結(jié)核患者MMP-9及TIMP-1蛋白表達IOD值的比較

3 討論

近年來ECM重塑在肺纖維化形成中的作用已成為當今的研究熱點，而ECM重塑的有兩種重要的細胞外基質(zhì)表達MMPS和TIMPs[5-6]。MMPs是一組鋅、鈣離子依賴性的蛋白水解酶家族，主要功能是在正常的重塑和修復(fù)過程中降解基底膜和間質(zhì)膠原等細胞外基質(zhì)成分，其活性主要受其特異性抑制劑TIMPs的調(diào)節(jié)[7]。組織金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）是MMP-9的特異性抑制劑，它以共價鍵的形式與MMP-9相結(jié)合成復(fù)合體，特異性抑制MMP-9活性是重要的蛋白質(zhì)降解調(diào)控因子。MMPs及TIMPs所調(diào)節(jié)的細胞外基質(zhì)降解減少可能是肺纖維化發(fā)生的重要因素，MMP-9能夠降解分布于基底膜和肺間質(zhì)的Ⅳ型膠原，TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑，由于膠原沉積在肺纖維化過程中起著關(guān)鍵的作用，膠原酶具有切割纖維膠原蛋白的天然螺旋結(jié)構(gòu)能力的下調(diào)，可能對疾病的進展也可以發(fā)揮顯著作用[8-10]。根據(jù)此觀察，TIMPs的過度表達導(dǎo)致MMPs和它的抑制因子之間失衡，從而引起不利于膠原活性的微環(huán)[11-12]。TIMP-1主要來自于肺泡巨噬細胞及上皮細胞，TIMP-2和TIMP-3的基因表達成組成型，TIMP-1在纖維化過程表達上調(diào)，TIMP-1的表達與疾病的進展階段相關(guān)聯(lián)，并且可能會阻止MMP導(dǎo)致的細胞外基質(zhì)的降解，并且作為結(jié)果可能參與了細胞外基質(zhì)的沉積，MMP-9的檢測被建議可作為肺纖維化的預(yù)后因素。

糖尿病為臨床常見的內(nèi)分泌代謝疾病，由于糖尿病的存在使肺結(jié)核惡化或難以治愈，肺結(jié)核的存在又可使糖尿病不易控制，兩者之間互為因果，造成惡性循環(huán)。而肺結(jié)核合并糖尿病的病因機制尚不完全清楚，近年來研究發(fā)現(xiàn)EMC的酶降解系統(tǒng)異常可能對糖尿病合并肺結(jié)核發(fā)病有一定的作用。而MMP-9的表達會抑制TIMP-1，MMPs的合成、分泌及激活過程的各個環(huán)節(jié)都受到嚴密監(jiān)控，一些細胞因子、生長因子及激素等能調(diào)節(jié)MMPs合成[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在本院入院的糖尿病合并肺結(jié)核的患者中活動性肺結(jié)核患者的比例顯著高于非糖尿病肺結(jié)核的患者，說明糖尿病對肺結(jié)核的活動性在一定程度上有影響，這可能與糖尿病會造成體內(nèi)高糖的環(huán)境，改變正常的代謝有關(guān)[15]。糖尿病的發(fā)生影響了EMC酶降解系統(tǒng)的異常表達，增加了肺結(jié)核的活動性。在分別檢測了肺結(jié)核合并糖尿病組、肺結(jié)核非糖尿病組、正常肺部組的MMP-9、TIMP-1及MMPs三組指標的比值，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核合并糖尿病組比值都較其他兩組顯著較高，且肺結(jié)核非糖尿病組的三項指標也較正常組的高，這也直接說明糖尿病對肺結(jié)核的發(fā)生有促進作用，MMP-9、TIMP-1及抗蛋白酶系統(tǒng)對糖尿病患者肺部纖維組織的形成有較大的影響，且MMP-9、TIMP-1及其比值與疾病的發(fā)生有著較為密切的關(guān)系。MMP-9及TIMP-1比率失衡是細胞外基質(zhì)重塑和氣道阻塞的關(guān)鍵，MMPs和其抑制因子的在其他呼吸道纖維化疾病時有研究，提示他們可能是氣道炎癥及氣道重塑有用的生物學標志。在筆者的研究中，灌洗液中細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達顯著升高，MMP-9/TIMP-1比率明顯失衡，筆者的結(jié)果提示基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）可能參與糖尿病合并肺結(jié)核的致病過程，對肺結(jié)核患者的預(yù)測及診治可能有一定的參考價值。隨后，筆者又將活動性肺結(jié)核患者和非活動性肺結(jié)核患者的三項指標進行對比，免疫組化的結(jié)果顯示活動性肺結(jié)核患者的MMP-9、MMP-9/TIMP-1值較非活動性的高，但TIMP-1蛋白的表達值卻較非活動性肺結(jié)核患者的低，差異均存在統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這再次說明MMP-9、TIMP-1的值與肺結(jié)核的病變程度密切相關(guān)，活動性肺結(jié)核患者的肺部纖維化更為嚴重，多項證據(jù)證實MMPs/TIMPs功能紊亂，尤其是TIMP-1的增多，MMP的活性會受到限制，可促進肺間質(zhì)纖維化形成。MMP-9/TIMP-1比率失衡可能是導(dǎo)致糖尿病合并肺結(jié)核患者發(fā)生肺部纖維化的重要因素。

本研究提示TIMP-1、MMP-9與糖尿病合并肺結(jié)核病變程度密切相關(guān)，尤其是對肺部纖維化有著重要影響，可作為鑒別糖尿病是否已合并肺結(jié)核的指標。MMP-9/TIMP-1比值的失衡在肺結(jié)核合并糖尿病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。此研究為糖尿病合并肺結(jié)核的病因?qū)W機制提供實驗支持，并為深入探索糖尿病合并肺結(jié)核機制提供一定的理論依據(jù)。

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