適合于基礎實驗教學的細胞凋亡檢測方法探索

王宏剛，徐欣欣，陳成彬，王春國，陳 力，宋文芹，白艷玲，張金紅，劉 方

（南開大學 生物實驗教學中心，天津 300071）

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是研究最為深入的細胞死亡方式之一，在細胞的生命周期中發揮著非常重要的生理學意義［1］。通過對細胞凋亡的檢測來評價細胞的生長狀態已經成為普遍使用的方法，被普遍應用在藥物的細胞毒性研究等多個領域［2－5］。在本科生的基礎性實驗課程中設計“細胞凋亡的檢測”實驗，可以幫助學生系統地學習檢測細胞凋亡的方法，掌握處于凋亡過程中細胞形態及其核酸發生的變化。檢測細胞凋亡的方法有很多，但適合本科生基礎性實驗教學的方法并不多。目前，針對細胞凋亡檢測方法的訓練也大多在綜合性或開放性實驗中進行［6－8］。探索如何在本科生的基礎性實驗教學中開設細胞凋亡檢測實驗，培養學生掌握快速、簡便地檢測細胞凋亡的方法就顯得尤為重要。

1 實驗材料與試劑

材料：小鼠淋巴瘤EL4細胞系（以下簡稱EL4細胞）

試劑：1 640培養基、胎牛血清、雙抗、VP－16、凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒、瓊脂糖、TAE電泳緩沖液、EB、PBS緩沖液、吖啶橙、臺盼藍

2 實驗方法

2.1 DNA梯狀帶電泳檢測細胞凋亡

向生長良好的EL4細胞中加入終濃度為0.1 mmol/L的 VP－16，繼續培養36～48h，離心收集細胞。使用“凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒”提取DNA。1.5%瓊脂糖凝膠低電壓（2～4V/cm）電泳。

2.2 吖啶橙熒光染色檢測細胞凋亡

向生長良好的EL4細胞中加入終濃度為0.1 mmol/L的VP－16，繼續培養36～48h；取細胞懸液，滴加0.01%吖啶橙染色液（PBS緩沖液配制）染色5 min；加蓋玻片，在熒光顯微鏡下選用寬譜紫外激發塊進行激發并觀察細胞發出的熒光。

2.3 臺盼藍染色法檢測細胞凋亡

向生長良好的EL4細胞中加入終濃度為0.1 mmol/L的VP－16，繼續培養36～48h；取細胞懸液，加入2%臺盼藍染色液染色2min；加蓋玻片，在普通光學顯微鏡下進行觀察。

3 實驗結果

3.1 DNA梯狀帶電泳檢測細胞凋亡

細胞發生凋亡的一個重要特征是其染色質發生濃縮，染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂。180～200bp整數倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜（見圖1）。

圖1 細胞凋亡DNA梯狀帶

3.2 啶橙熒光染色檢測細胞凋亡

吖啶橙可以通過完整的膜結構使DNA和RNA著色。在熒光顯微鏡下，可觀察到正常活細胞的細胞核經吖啶橙染色后呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。發生凋亡的細胞中，核呈黃綠色，斷裂為多個碎塊狀，碎裂的核由膜包裹著凸起于細胞表面呈黃綠色（見圖2）。

3.3 臺盼藍染色法檢測細胞凋亡

臺盼藍不可以通過完整的細胞膜。經臺盼藍染色后，發生壞死的細胞呈藍色。正常細胞和凋亡細胞不著色，發生凋亡的細胞在細胞膜上可見凸起的凋亡小泡（見圖3）。

圖2 吖啶橙染色顯示凋亡細胞（箭頭所示）（400×）

圖3 臺盼藍染色法檢測細胞凋亡（400×）

4 討論

4.1 實驗材料的選擇

在設計細胞凋亡的檢測實驗時，實驗材料的選擇非常重要。本科生基礎實驗教學使用的細胞系應該具備培養條件簡單、生長較快等特點，以降低培養的難度。如：Hela細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞、EL4細胞等都是比較合適的細胞株系。選用懸浮生長的細胞系可以省去胰酶消化細胞的步驟，使實驗過程更加簡潔，提高實驗的成功率。

4.2 誘導方法的選擇

誘導細胞凋亡的方法有很多種，如紫外線照射、藥物誘導等［9－11］。其中，藥物誘導有著可控性好的優點。通過選擇藥物的濃度和處理時間可以控制細胞凋亡的程度，以便在教學時能夠向學生提供合適的實驗材料，幫助學生觀察細胞發生凋亡時的典型特征。

4.3 檢測方法的選擇

細胞凋亡的檢測方法有很多，基本上分為形態學觀察、DNA電泳、蛋白分子的生化檢測3類［12－13］。本文選擇了具有代表性的DNA梯狀帶電泳、吖啶橙熒光染色法和臺盼藍染色法3種實驗方法為本科生開設基礎實驗課。DNA梯狀帶電泳主要是依據細胞發生凋亡時DNA在核小體連接處發生斷裂的特點來對細胞的凋亡進行檢測。吖啶橙熒光染色法和臺盼藍染色法根據細胞凋亡時形態的變化來檢測細胞凋亡。

通過這3個代表性的實驗，學生不但可以直觀地觀察到細胞形態發生的變化，如細胞核的變形、凋亡小泡的形成等，還可以通過了解細胞DNA斷裂的方式理解細胞程序性死亡的概念。

4.4 教學的組織

作為基礎實驗，課時是最重要的一個限制性因素，需要在固定且較短的時間內完成實驗，這就需要實驗的步驟要盡量簡潔。基礎性實驗開設的對象一般為大學一年級或二年級的學生，要求實驗原理不能太深奧，實驗操作不能太復雜。

相對于其他檢測方法而言，吖啶橙熒光染色法和臺盼藍染色法的操作復雜度不高，每個實驗均可以在1個學時內完成。DNA梯狀帶電泳中涉及到DNA的提取和瓊脂糖電泳技術。DNA的提取使用試劑盒大約需要1個學時，瓊脂糖電泳大約需要2個學時。可以在進行電泳的同時，進行吖啶橙熒光染色法和臺盼藍染色法檢測細胞凋亡的實驗。通過這樣的安排，可以在4個學時內完成整個實驗。

5 結束語

細胞凋亡的檢測是生命科學類本科生實驗教學中的一個重點，應該將這一知識點的教學引入基礎性必修實驗課程，使其成為學生牢固掌握的基本實驗技能之一。在此基礎上進行細胞凋亡相關的綜合性實驗或科研訓練時的教學效果會更好，學生得到的收獲也會更多。

（

）

［1］翟中和，王喜忠，丁明孝，等.細胞生物學［M］.4版.北京：高等教育出版社，2011.

［2］馮麗，金永哲，劉磊，等.Peroxiredoxin V保護 HT22小鼠海馬神經細胞抵抗NO誘導的細胞凋亡［J］.中國細胞生物學學報，2015，37（1）：53－58.

［3］趙夢，蔣勇，楊璞，等.呼吸道合胞病毒非結構蛋白1對凋亡調節機制的研究［J］.生物醫學工程與臨床，2015，19（1）：60－65.

［4］朱迪，張小天，劉毅，等.鳶尾素通過抑制氧化應激減輕高糖/高脂誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷［J］.心臟雜志，2015，27（5）：506－509.

［5］李寶霞，張鵬，楊雨虹，等.水飛薊賓聯合5FU抑制胃癌MGC803細胞增殖及機制［J］.暨南大學學報，2014，35（2）：142－147.

［6］張金紅，劉方，白艷玲，等.生物科學綜合實驗的探索和實踐［J］.實驗技術與管理，2009，26（4）：193－194.

［7］翁秀芳，袁萍，沈關心，等.“細胞凋亡的誘導與檢測”整合性實驗的實踐與探索［J］.中國免疫學雜志，2013，29（2）：202－204.

［8］李衛紅，張海燕，董凌月.五年制基礎醫學專業熒光雙染法分析細胞凋亡與細胞壞死的實驗設計［J］.山西醫科大學學報：基礎醫學教育版，2010，12（增刊2）：74－75.

［9］賈松柏，石晶明，陳翾，等.紫外線對人晶狀體上皮細胞凋亡的誘導及Bcl－2，Bax基因的影響［J］.中南大學學報：醫學版，2012，37（7）：730－736.

［10］李中東，齊振華，舒義剛，等.G－CSF對VP16誘導白血病細胞凋亡及Survivin mRNA表達的調控作用［J］.天津醫藥，2006，34（10）：682－685.

［11］王琰，陸園園，鮑維維，等.色霉素A2誘導人肝癌HepG2細胞凋亡［J］.南方醫科大學學報，2014，34（10）：1449－1453.

［12］斯佩特克 D L，戈德曼R D，萊因萬德 L A.細胞實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京：科學出版社，2001.

［13］高超，華子春.細胞凋亡檢測方法新進展［J］.中國細胞生物學學報，2011，33（5）：564－569.