研究創新性化學開放實驗教學設計——鏈霉菌化感活性物質的提取與分離

李春遠，盧其明，陳 敏，羅志剛

（1.華南農業大學 材料與能源學院，廣東 廣州 510642；2.華南農業大學 公共基礎課實驗教學中心，廣東 廣州 510642）

公共基礎課實驗教學中心的基礎化學實驗室每年承擔資源環境、生命科學、園藝、食品科學、獸醫、動物科學、林學、工程、水利與土木工程、理學、農學等11個學院共30多個本科專業開設的6門化學類實驗課程，每年上課學生超過4 000人，學生人數多，教學層次多樣。所以，從2011年開始，化學實驗室結合授課學生專業不同特點，提出了“分層次，跨專業”開放實驗教改思路，即根據開放對象專業不同及其與化學學科的相關度進行分類，將參與開放實驗的學生分為非化學類、農科類、理工科類、化學類等類型，開放教學內容則分為趣味性、基礎性、綜合設計性和研究創新性4個教學層次。教學中針對不同專業的學生，選擇不同的實驗內容進行分層教育。經過數年的教學實踐，該模式取得了良好的教學效果。

研究創新性實驗教學強調學生的探究和創新，目標是培養學生的創新能力、創新意識、合作精神與科學態度，是完成高校創新人才培養目標的有效途徑。在教學過程中創立一種類似科學研究的氛圍，學生在教師引導下，用類似科學研究的方式，主動地去進行探索、研究、發現和體驗，學會對信息進行收集、對現象進行分析和判斷，通過總結獲取知識，通過研究應用知識，從而達到增強思考能力和創造能力、培養創新精神和實踐能力的目的［1－2］。“研究創新性教學”已經成為發達國家一流大學推崇的教學改革模式［3］。

鏈霉菌屬是絕大多數已知抗生素和一些重要化感活性物質的產生菌［4－8］。在微生物化感活性物質研究中，菌株一般要經過液體深層發酵來產生目標產物，然后對發酵液中活性成分進行提取、純化再分離出活性物質。大孔吸附樹脂具有的低消耗、高效率、高選擇性、后續處理簡單并且樹脂可再生等優勢，其在農藥、生化藥物的分離純化以及中成藥的制備等方面［6，9］的應用越來越廣泛。把這些新的實驗方法及實驗技術運用到實驗教學中來，讓學生探索實驗規律、優化反應條件、降低化學實驗室污染的同時，培養學生的實驗技能、科研創新能力及環境保護意識，從而達到提高教育和教學質量的目的。

1 優選實驗教學材料

微生物中產生抗生素種類和數量最多的類群是放線菌群，用于植物病害生物防治中的主要是鏈霉菌屬及其相關類群［10］，其中許多已經被開發成除草劑、殺菌劑和殺蟲劑等［11－12］。作為農業院校，基礎化學實驗是農業院校最重要的公共基礎課之一，所以開設一些與農業專業相關的實驗項目有助于學生以后的專業學習。而從學生實驗教學的時效性考慮，鏈霉菌屬成為首選，同時，作為學生實驗，也不宜采用未研究過的新奇菌株為教學對象。所以從本實驗室已篩選獲得的具有抑菌及除草活性的放線菌中，選擇了一株對多種病原菌具有強烈抑制作用并對稗草也具有抑制作用的鏈霉菌6803菌株作為研究創新性實驗設計教學的材料［13］。

2 設計實驗技術流程

“研究創新性教學”的基本特點之一是主張教學方法和手段的多樣性，為實現多元化的教學目標，應采用多種教學方法并充分運用現代教育技術［14］。近年來，一些新的綠色化的實驗方法更多被引進到化學開放實驗教學中來，運用這些新的實驗方法及新技術，讓學生探索實驗規律，降低化學實驗室污染，同時也可以激發學生學習化學的興趣。以活性微生物發酵液為原料，用活性跟蹤的方法測定4種不同極性的大孔吸附樹脂（NAK－II，AB－8，X－5，HP－20）填料對該菌株發酵液除草活性物質的吸附能力，從中篩選最佳的吸附樹脂，并篩選其最佳洗脫劑，提取后的粗提物用制備薄層色譜進行分離、純化得到目標產物。實驗設計技術流程如圖1所示。

圖1 實驗設計技術流程圖

3 優選提取、分離及純化方法

3.1 大孔吸附樹脂提取活性物質

研究創新性教學的目的是要增強教學過程中學生的主體地位，體現以“學生發展”為本的教育思想內涵［15－16］。學生通過查閱大量的相關資料獲知，在微生物發酵液農用活性物質提取研究中，可以采用溶媒萃取，但溶媒萃取需要大量互不相容的溶劑，萃取過程中還可能會產生乳化現象，定量分析回收率低，萃取時間長，消耗溶劑量大。而大孔吸附樹脂具有吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、再生處理簡單、用少量樹脂就可以處理大量發酵液等優點，而且在提取的同時也有一定的純化作用，該方法克服了液液萃取過程因溶劑揮發而污染環境，并且吸附樹脂還可以再生后繼續使用［17］。

從開放學生實驗綠色化的角度考慮，決定采用4種不同極性的大孔吸附樹脂（NKA－II、AB－8、X－5、HP－20）對發酵液的目標產物進行提取。發酵液是教師提前準備好分發給各組學生的。實驗結果顯示，樹脂HP－20對發酵液的吸附效果最好，樹脂HP－20對發酵液的靜態吸附量約可達到樹脂體積的8倍，用樹脂2～3倍柱體積的80%乙醇—水溶液則可以把吸附的活性物質全部從樹脂中解吸出來。該方法既克服了液液萃取過程中溶劑揮發對環境的污染，又節省大量的有機溶劑，并且樹脂再生后可以繼續使用，既節能又環保。

3.2 采用超聲波法洗脫目標產物

利用超聲波的空化作用加速活性成分的溶出。我們把已經被發酵液吸附飽和的樹脂從層析柱中倒出來，不用以前常規的方法，而改為把吸附飽和的樹脂置于三角瓶中，然后先用蒸餾水浸泡，再超聲6min，用布氏漏斗抽濾，目的是洗去雜質，濾液保留備用；將飽和吸附的樹脂重新轉移至三角瓶中，用前面已經篩選過的最佳洗脫劑即80%乙醇—水溶液進行洗脫。與普通動態洗脫相比，本方法只用1/3的溶劑即可洗脫出相同的提取量，同時還節省了大量的時間和能源。本步驟完成后繼續用蒸餾水對樹脂進行洗滌，把乙醇洗干凈，樹脂即可再次循環使用。對收集的濾液用旋轉蒸發儀進行減壓蒸餾，在較低的溫度下快速地對樣品進行濃縮，收集到的試劑還可以回收再利用。

3.3 制備薄層分離目標產物

制備薄層層析原理與柱層析相似，都是利用硅膠吸附性能使得不同物質在各種極性溶劑條件下解吸能力差異而進行分離純化［18］。制備薄層層析使用購置的薄層板，在開放實驗中提取活性物質的量較少的情況下，制備薄層層析的分離效果要優于柱層析。引導學生慢慢地將樣品刷到制備薄層板上，然后在層析缸中慢慢展開，對前面的粗提物進行分離，把點好樣的制備薄層板置于展開缸中，比較適合學生實驗少量樣品的分離純化，展開后用紫外等顯色劑檢驗，刮取活性物質色譜帶，再上小柱，用少量極性較大的溶劑在色譜柱中把活性物質洗脫下來。制備薄層法比柱層析法更加簡便，消耗的溶液量少、時間短且綠色化，在1h內，只用150mL試劑即可獲得10mg的7，4’—二羥基黃酮（7，4’—dihydroxyflavone）目標產物。

4 用核磁共振譜表征活性物質結構

核磁共振（NMR）儀是天然產物結構鑒定及化學反應機理研究等最常用的工具之一［19－20］，學生首先對薄層制備純化后得到的產物進行薄層檢視，選取了斑點單一、純度高的樣品。樣品用真空干燥后，由于比較難溶，所以用DMSO－d6溶劑溶解后裝入核磁管中，用Bruke AV600超導磁核磁共振儀得到NMR的H譜和C譜圖見圖2和圖3，并與文獻［8，21］對照，鑒定該化合物為7，4’—二羥基黃酮（7，4’—dihydroxyflavone）。

學生通過總結獲取知識，通過研究應用知識，從而達到增強思考能力和創造能力、培養創新精神和實踐能力的目的。實驗結束后，大家集中共同分析實驗過程出現的問題并分析實驗結果。在實驗過程中，有些學生因為裝填料時沒裝密實，加載發酵液的時候，吸附樹脂會浮起來。大家熱烈地討論實驗的每一個步驟，交流經驗，對不滿意的實驗內容進行重做，直到得出較為滿意的實驗結果。實驗結束后，每組的小組長匯集組員的實驗過程資料和實驗結果，分析實驗過程中出現的問題、解決方法及實驗后組員討論的實驗結果，提出實驗存在的問題，把實驗結果進行整理，制作成PPT，大家相互交流，共同提高。大部分的實驗組都能得出較理想的實驗結果。

圖2 化合物I的1 H－NMR譜

圖3 化合物I的13C－NMR譜

5 結束語

近幾年來的探索與實踐證明，“研究創新性實驗”的實驗教學模式能適應當前教學改革的要求，能激勵學生的求知愿望，能激發學生的成就感與創新欲望，有利于提高學生的實驗技能、科研意思和科研能力。近年來，學生獲得多項國家級、省級及校級的獎勵。下一步將積極配合學校實踐教學改革，將重點放在學生科研能力的培養上，充分激發學生的科學激情，并隨時根據實驗情況調整實驗教學方式，真正做到對學生的科學意識、科研能力及創新能力的培養。

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