Bcl-2基因敲除對人胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響

魏莉 張海文 涂芊茜 劉斌 蔡宏劍 孫春亮 陳海濤

·論著·

Bcl-2基因敲除對人胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響

魏莉 張海文 涂芊茜 劉斌 蔡宏劍 孫春亮 陳海濤

目的探討Bcl-2基因對人胰腺癌SW1990細胞增殖及凋亡的影響。方法設計并合成靶向Bcl-2基因的sgRNA(Bcl-2-sgRNA)，通過CRISPR-Cas9系統將其結合到CRISPR載體Cas9，經測序驗證后轉染人胰腺癌細胞株SW1990，篩選Bcl-2基因敲除穩轉細胞，以野生型SW1990細胞作為對照。采用CCK-8法測定細胞生長曲線，通過克隆形成實驗計數細胞克隆數，運用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。結果成功獲得Bcl-2基因敲除的人胰腺癌SW1990細胞株，其Bcl-2蛋白表達缺失。與野生SW1990細胞比較，敲除Bcl-2基因的SW1990細胞的生長被抑制，細胞克隆形成數量顯著減少[(160.7±10.0)個比(285.3±14.2)個]，G1期細胞比例顯著增加[(84.51±0.97)%比(57.49±1.08)%]，S期細胞比例顯著減少[(12.82±0.99)%比(27.56±1.65)%]，細胞凋亡率顯著增加[(12.67±0.59)%比(0.37±0.35)%]，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。結論敲除Bcl-2基因可抑制胰腺癌SW1990細胞的生長，降低細胞克隆形成能力，使細胞阻滯在G1期，并顯著增加細胞凋亡率。

胰腺腫瘤； 基因，bcl-2； CRISPR-Cas9； 細胞增殖； 細胞凋亡

胰腺癌發病隱匿，惡性程度高，早期診斷困難，易發生轉移，且預后較差，5年總生存率不到5%[1-3]，因此，探索胰腺癌的發病機制，尋找準確的治療靶點，對提高胰腺癌患者的生存率，改善其預后具有重要意義。Bcl-2(Bcell lymphoma-2)是凋亡抑制基因，在胰腺癌組織中呈高表達[4-5]，提示其參與了胰腺癌的發生和發展過程。本研究采用成簇的規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)相關蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) associated proteins 9，CRISPR-Cas9]系統靶向敲除胰腺癌細胞Bcl-2基因，觀察其對胰腺癌細胞生物學特性的影響，以期為胰腺癌的治療提供新的靶點和策略。

材料與方法

一、插入靶向Bcl-2-sgRNA的重組質粒構建

通過http://crispr.mit.edu網站設計靶向Bcl-2外顯子1的短的引導RNA(Bcl-2 short guide RNA，Bcl-2-sgRNA)，正義序列為5′-CACCGAGGAGAAGATGCCCGGTGCG-3′，反義序列為5′-AAACCGCACCGGGCATCTTCTCCTC-3′。同時設計鑒定CRISPR引物，正義序列為5′-TTGCTTTTCCTCTGGGAAGGATG-3′，反義序列為5′-TGGATCTCCACGACTAGCAAGCAA-3′。引物設計及合成均由上海瀚宇生物科技有限公司提供。重組質粒的序列信息見圖1。

圖1 pX335重組質粒示意圖

取等量合成的寡核苷酸上下游混合(10 μmol/L)，經98℃退火后自然降至室溫(約2 h)以形成雙鏈sgRNA，應用T4 DNA酶將雙鏈sgRNA連接到Cas9(pX335)質粒。Cas9(pX335)質粒為復旦大學生命科學院吳家雪老師惠贈。連接反應：T4 DNA 10× Buffer 1 μl，雙鏈sgRNA(10 μmol/L)4 μl，Cas9(pX335)質粒0.5 μl，T4 DNA酶0.3 μl(紐英倫生物技術北京有限公司)，ddH2O 4.2 μl，置室溫連接1 h。將重組質粒轉化DH5α感受態細胞，常規培養18～24 h，挑取單克隆菌落，提取質粒DNA并測序驗證。

二、細胞培養和轉染

胰腺癌細胞株SW1990購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心，常規培養、傳代。取對數生長期細胞接種至6孔板中培養24 h，待細胞融合度達到60%～70%時使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagen(羅氏公司)將質粒DNA轉染細胞，按說明書操作，以未轉染的親本細胞作為陰性對照。轉染細胞命名為SW1990/Bcl-2-sgRNA。

Bcl-2-sgRNA質粒轉染SW1990細胞48 h后，采用有限稀釋法，將單細胞懸液按1∶20、1∶40、1∶80稀釋濃度接種于10 cm培養皿，待細胞長成單克隆細胞團后，用胰蛋白酶消化細胞并接種至24孔板中，細胞生長至布滿24孔板底3/4時收集細胞，裂解獲得細胞蛋白，應用蛋白質印跡法檢測敲除Bcl-2基因的SW1990細胞的Bcl-2蛋白表達以驗證Bcl-2敲除是否成功，實驗重復3次。然后將陽性克隆行PCR擴增后測序驗證。

四、CCK-8法檢測細胞生長曲線

分別取對數生長期SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板，每孔100 μl，分別培養1、2、3、4、5、6 d，小心吸棄孔內培養上清液，加入含10% CCK-8的100 μl無血清培養基，37℃孵箱避光孵育2 h。測各孔在450 nm波長時的吸光度值(A450值)。實驗重復3次，取均值。

五、克隆形成實驗

分別取對數生長期SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞，以每孔300個細胞接種于6孔板，常規培養12 d，多聚甲醛固定60 min，結晶紫染色20 min，1×PBS清洗后晾干攝片，利用Image J(1.48V)軟件自動計數克隆數。

六、流式細胞儀測定細胞周期

分別取對數生長期SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞，PBS洗滌后再加入500 μl含50 μl/ml碘化并啶(PI)、100 μg/ml RNase A、0.2% Triton X-100的PBS，輕輕混勻，室溫避光反應15～20 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

在缺陷分析中可以使用統計方法對收集的缺陷進行分類、匯總。基于不同的缺陷屬性，根據需要統計缺陷分布情況，利用統計結果分析缺陷產生的根本原因，將其成為改進軟件測評過程的依據。缺陷統計內容包括：

七、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

分別取對數生長期SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞，PBS洗滌后調整細胞密度為1×106/ml，每100 μl細胞懸液加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后室溫避光放置10～15 min，離心，用結合緩沖液洗滌1次，重懸細胞于200 μl緩沖液中，加入5 μl PI(5 μg/ml)，避光放置10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

八、統計學處理

結 果

一、Bcl-2-sgRNA重組質粒及穩轉SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞株鑒定

經測序顯示有2個不同的敲除Bcl-2基因的重組質粒，它們的sgRNA插入序列的位置、方向及序列與預期相符，但1個重組質粒為第1外顯子424 bp處缺失TGAACTGGG 9個堿基及435 bp處缺失1個堿基G，1個重組質粒為第1外顯子398 bp處缺失2個堿基TG(圖2)。

圖2 2個重組質粒的序列

2個重組質粒分別轉染的SW1990細胞的Bcl-2蛋白表達均缺失(圖3)，證明SW1990細胞Bcl-2基因靶向敲除成功。選取重組質粒-1轉染的SW1990細胞進行后續實驗。

二、SW1990細胞增殖的變化

SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的生長較SW1990細胞緩慢，培養2 d后兩組的差異有統計學意義(圖4、表1)，提示Bcl-2基因敲除后細胞的生長受抑制。

圖3 SW1990細胞(1)及2個SW1990/Bcl-2-sgRNA(2、3)的Bcl-2蛋白表達

圖4 SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的生長曲線

培養天數SW1990SW1990/Bcl-2-sgRNAt值P值00.53±0.000.52±0.002.0340.11210.68±0.010.61±0.026.6230.00320.89±0.010.71±0.0121.0220.00031.35±0.061.08±0.065.5560.00542.24±0.071.76±0.106.8400.00253.25±0.132.52±0.195.4830.00563.64±0.182.99±0.105.5620.005

三、SW1990細胞克隆形成能力變化

SW1990細胞的克隆形成數為(285.3±14.2)個，SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的克隆形成數為(160.7±10.0)個，SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞克隆數較SW1990細胞顯著減少，差異有統計學意義(t=12.432，P<0.01，圖5)。

圖5 SW1990(5A)及SW1990/Bcl-2-sgRNA(5B)的細胞克隆

四、SW1990細胞周期的變化

SW1990 細胞的G1、S期細胞的比例分別為(57.49±1.08)%、(27.56±1.65)%；SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞比例分別為(84.51±0.97)%、(12.82±0.99)%，SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的G1期細胞數較SW1990細胞顯著增加，而S期細胞數顯著減少，差異均有統計學意義(t值分別為-32.32、13.23，P值均<0.01，圖6)。

圖6 SW1990(6A)及SW1990/Bcl-2-sgRNA(6B)細胞周期

五、細胞凋亡的變化

SW1990細胞的凋亡率為(0.37±0.35)%；SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞為(12.67±0.59)%，SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的凋亡率顯著高于SW1990細胞，差異有統計學意義(t=54.74，P<0.01，圖7)。

圖7 SW1990(7A)及SW1990/Bcl-2-sgRNA(7B)的細胞凋亡

細胞凋亡可清除機體發育不正常的細胞及衰老細胞，以維持機體各器官及內環境的穩定性。細胞凋亡的下調或者功能失控會引起腫瘤的發生。細胞凋亡分為內源性(線粒體)途徑及外源性(死亡受體)途徑，內源性途徑主要通過p53、Bcl-2家族協助凋亡信號的啟動；外源性途徑主要通過激活Caspase級聯反應從而促進細胞凋亡[6]。Bcl-2是凋亡抑制基因之一，屬于癌基因家族成員，位于18號染色體長臂21區，全長720 bp，由3個外顯子、2個啟動子及2個內含子組成，編碼一種細胞跨膜蛋白，含有293個氨基酸，分子質量約為26 000，主要定位于線粒體、部分內質網和核膜。Bcl-2基因由18號染色體易位到14號，與免疫球蛋白重鏈基因并列相連，導致基因過表達[7]。研究發現Bcl-2蛋白可在淋巴瘤、乳腺癌、白血病、滑膜肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、肝癌等多種腫瘤組織中表達上調[8-15]。

基因敲除是一種遺傳工程基因修飾技術，它針對某個遺傳基因，運用一定的生物學技術使其特定的功能缺失，通過可能對相關生命現象造成的影響推測該基因的生物學功能。傳統基因敲除主要利用RNAi、Cre/LoxP、ZFN和TALEN等系統，通過插入突變和基因靶向技術使目的基因的功能喪失，而CRISPR-Cas系統是利用與目的基因具有同源性的sgRNA特異性結合到基因組DNA，成為一種新型的基因組編輯工具，具有操作便捷、效率高、成本低、可同時沉默任意數量的單個基因等優點，已在原核的遺傳學研究、抗病毒和生物技術等領域獲得了廣泛的應用，表現出較強的基因組編輯活性[16]。

CRISPR-Cas系統是一些細菌和古菌在噬菌體長期選擇壓力下進化出來的一種有效抵御外源DNA入侵的免疫機制之一，它由一個成簇規則間隔的短回文重復序列(CRISPR)和附屬的蛋白質(Cas)組成[17]。CRISPR-Cas系統依據主要的核心組成元件和序列可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種類型，其中Ⅱ型來源的Cas9蛋白表現出非常強的DNA裂解活性。在菌體內，CRISPR簇首先轉錄成前體CRISPR RNA，然后在tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)-Cas9復合物加工后生成CRISPR RNA，CRISPR RNA 的5′端能與靶位點互補配對， 3′端能與tracrRNA-Cas9蛋白形成復合物，識別結合外源DNA特定序列，特異性地切割靶位點，沉默內源基因的表達[18]。

本研究建立了Bcl-2基因敲除的人胰腺癌SW1990細胞株。Bcl-2基因敲除后的細胞生長受到抑制，克隆形成數量減少， G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，同時細胞凋亡率增加，證實Bcl-2基因在胰腺癌發生、發展中起重要作用，提示Bcl-2基因可作為臨床治療的新靶點。

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(本文編輯：呂芳萍)

2015年第二屆天津胰腺疾病高峰論壇通知

由中國醫師協會胰腺病學專業委員會主辦，武警后勤學院附屬醫院、《中華胰腺病雜志》雜志社和《武警后勤學院學報(醫學版)》雜志社聯合承辦的“2015年天津胰腺疾病高峰論壇”將于2015年10月17日在天津召開。本次論壇將邀請包括李兆申教授在內的全國知名專家、教授進行有關急性胰腺炎的最新理論技術的介紹和交流，包括復發性急性胰腺炎診治進展、重癥急性胰腺炎的內科、外科和營養治療等內容。

本次論壇免注冊費，參會代表均可獲得國家級繼續醫學教育Ⅰ類學分5分，熱烈歡迎同道們參加！

聯系地址：天津市河東區成林道220號 武警后勤學院附屬醫院肝膽胰脾中心；郵編：300162。

聯系人：牛海艷，手機13752207803，Email：13752207803@163.com，有意參會者請通過短信或郵件提供姓名、性別和單位等基本信息。

Effects of knocking out Bcl-2 gene on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer cells SW1990

WeiLi,ZhangHaiwen,TuQianqian,LiuBin,CaiHongjian,SunChunliang,ChenHaitao.

DepartmentofOncology, 401HospitalofPLA,Qingdao266071,China

SunChunliang,Email:sunchunliang5366@sina.com;ChenHaitao,Email:medchenhaitao@163.com

Objective To investigate the effect of Bcl-2 gene expression on the proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer SW1990 cells. Methods Bcl-2 short guide RNA (Bcl-2-sgRNA) was designed and synthesized, and it was combined with CRISPR-Cas 9. After confirmation by gene sequencing, it was transfected into human pancreatic cancer cell line SW1990, then the cells with stable Bcl-2 gene knock-out were selected, and wild type SW1990 cells were used as control. The cell growth curve was determined by CCK-8 method. The number of clone formation was measured. Flow cytometry was used to measure cell cycle and apoptosis. Results Human pancreatic cancer cell line SW1990 with Bcl-2 gene knock-out was successful constructed. Compared with wild type SW1990 cells, the growth of SW1990 cells with Bcl-2 gene knock-out was inhibited, the number of clone formation was significantly decreased [(160.7±10.0)vs(285.3±14.2)], the proportion of G1cells was significantly increased [(84.51±0.97)%vs(57.49±1.08)%], the proportion of S phase cells significantly decreased [(12.82±0.99)%vs(27.56±1.65)%], and apoptosis rate was remarkably increased [(12.67±0.59)%vs(0.37±0.35)%], and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.01). Conclusions Knock-out of Bcl-2 gene can inhibit the growth of human pancreatic cancer cell line SW1990, decrease the ability of clone formation, block the cell in G1phase and greatly increase cell apoptosis rate.

Pancreatic neoplasms； Genes, bcl-2； CRISPR-Cas9； Cell proliferation； Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.04.005

266071 青島，解放軍第401醫院腫瘤科(魏莉、張海文、劉斌、蔡宏劍)，普外科(孫春亮)；第二軍醫大學長海醫院老年病科(涂芊茜、陳海濤)，消化內鏡中心(陳海濤)

陳海濤，Email：medchenhaitao@163.com；孫春亮，Email：sunchunliang5366@sina.com

2015-04-08)