桑葉、桑枝、桑椹多糖的提取及含量測定

摘要：目的 提取純化桑葉、桑枝、桑椹多糖并測定其含量。方法 用水提醇沉法提取桑葉、桑枝、桑椹多糖。苯酚-硫酸紫外分光光度法測定桑葉、桑枝、桑椹多糖的含量。結果 果實桑椹中多糖含量最多，其次為桑葉，桑枝中多糖含量較少。結論 通過測定比較桑樹不同藥用部位的多糖含量，以充分開發利用桑樹這一藥用資源，同時為深入開發桑葉、桑枝、桑椹新資源提供有利的實驗數據。

關鍵詞：多糖；含量；提取

多糖在自然界中分布十分廣泛，大多數高等植物、微生物、地衣、海藻和動物體內均有豐富的多糖。多糖作為初級代謝產物，不僅具有結構、支持與保護、能量來源和解毒作用等生物學功能，而且大多數具有明顯的藥理活性[1～3]。

桑葉、桑枝、桑椹為桑科Moraceae植物桑Morus alba L.的干燥葉，嫩枝和果實。桑葉始載于《神農本草經》，味苦、甘，性寒，歸肺、肝經，具有疏風清熱、平肝明目的功效；歷代中醫藥書籍中記載桑葉能夠治療消渴癥，現代藥理研究表明桑葉有效成分之一桑葉多糖具有顯著的降血糖作用。其所含化學成分種類較多，主要有多糖、黃酮類化合物，現代藥理學研究表明桑枝具有抗真菌活性、抗炎、降血糖等作用。桑椹子為桑的果穗，又名桑果、桑實、桑棗等。質油滑，氣微，味微酸而甜。我國許多地區都有分布，中醫用于治療肝腎陰虧、消渴、耳鳴、關節不利等癥。

桑葉、桑枝、桑椹作為中醫常用藥有如此多的功效，目前有關桑樹單個藥用部位的多糖提取和含量測定略見報道。本實驗采用水提醇沉法提取桑葉、桑枝、桑椹多糖。苯酚-硫酸比色法對其三者多糖的含量進行測定。通過測定比較桑樹不同藥用部位的多糖含量，以期充分開發利用桑樹這一藥用資源，同時為深入開發桑葉、桑枝、桑椹新資源提供有利的實驗數據。

1材料、儀器及試劑

1.1原料 桑葉、桑枝、桑椹的干燥葉，嫩枝和果實。購于杭州市老百姓大藥房。

1.2儀器 SPC22型紫外分光光度計，HH-S型電熱恒溫水浴鍋，超導熱風干燥箱，循環水式多用真空泵，分析天平，旋轉蒸發儀。

1.3試劑 95%乙醇，蒸餾水，苯酚，濃硫酸及其他試劑均為分析純，葡萄糖對照品，氯仿，正丁醇，活性碳。

2實驗方法和結果

2.1多糖的提取純化 分別稱取桑葉、桑枝、桑椹各50.0 g，以6倍量蒸餾水先回流提取1h，趁熱過濾，得濾液和殘渣，將殘渣再加6倍量蒸餾水提取45min。合并2次濾液，減壓濃縮至約150mL。再加入活性炭脫色，攪拌均勻，靜置過夜，多次過濾濾除活性炭，濾液再加入氯仿與正丁醇（4：1）混合液進行萃取脫蛋白，取上清液加95%乙醇醇析，使溶液含醇量達80%，靜置沉降24h，醇析物抽干，得粗多糖。粗多糖沉淀用無水乙醇洗滌數次，60℃以下烘干，即得多糖無定形粉末。精密稱重備用。

2.2多糖含量的測定

2.2.1苯酚試劑的配制 取苯酚200g，加鋁片0.2g和NaHCO3 0.1g，蒸餾，收集182℃餾分，稱取5g，加水100ml溶解混勻，即得。置棕色瓶內放冰箱中備用。

2.2.2最大吸收波長的選定 精密量取葡萄糖標準品貯備液1.0 ml置于15 ml具塞試管中，加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對照，于450～550nm波長范圍內測定吸收度。確定最大吸收波長為490nm。

2.2.3標準曲線的制備 精密稱取105℃烘至恒重的葡萄糖標準品10.3 mg水溶解并定容至100ml容量瓶中，則其濃度為103ug/ml。精密吸取葡萄糖標準貯備液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml置于15ml的具塞干燥試管中，加蒸餾水定容至1ml，再分別加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對照，于其最大吸收波長490nm處測其吸光度值。見表1，圖1。

圖1 標準曲線圖

2.2.4樣品溶液的制備 精確稱取60℃干燥恒重的桑葉、桑枝、桑椹多糖各13.5mg，水溶解后定容到10ml容量瓶中，搖勻，做為多糖儲備液。濃度為1.35 mg/ml。

2.2.5樣品含量測定 精密吸取1.0ml樣品溶液置于10ml的具塞干燥試管中，分別加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對照，于其最大吸收波長490nm處測其吸光度值。用回歸方程計算各樣品中桑葉多糖的含量為3.29%，桑枝多糖的含量為2.80%，桑椹多糖的含量為7.48%。見表2。

2.2.6精密度試驗 精密吸取1.0ml樣品溶液置于10ml的具塞干燥試管中，分別加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對照，于其最大吸收波長490nm處測其吸光度值，重復測定吸光度5次。見表3。

2.2.7穩定性試驗 精密吸取同一樣品溶液1.0ml，按樣品測定方法操作，每隔15min測定一次吸光度。吸光度分別為：0.556，0.553，0.555，0.555，0.557，0.559，0.552，0.559。實驗結果表明，樣品溶液在2h內吸收度基本無變化。

2.2.8回收率實驗 精密吸取樣品液0.3 ml，分別加入標準液0.2ml，加入5%苯酚1ml，混勻，迅速加濃硫酸5ml，混勻，放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后置冷水浴中冷卻5min。另以1.0ml蒸餾水同上平行操作為空白對照，于其最大吸收波長490nm處，測其吸光度值。見表4。

3討論

3.1苯酚-硫酸法的原理為多糖在濃硫酸作用下先水解成單糖分子，并迅速脫水成糠醛衍生物，糠醛衍生物再與酚性物質如苯酚綜合成有色化合物，以比色法在適當波長處測定多糖含量[4～6]。

3.2本文對桑葉，桑枝，桑椹的含糖量測定方法進行了摸索，最后確定了在490nm波長處進行比色測定的方法。結果表明，該方法簡便、快速、準確，靈敏度高，專屬性強，是進行該類成分測定的較理想方法。

3.3多糖沉淀中的主要雜質為色素、植物蛋白質。蛋白質的去除方法有鹽析法、等電點沉淀法、加熱變性法、有機溶劑變性萃取法、膜過濾法。加熱變性法不能完全除去蛋白，等電點沉淀法要求操作精細，單一等電點不能滿足除盡蛋白的目的，膜過濾法費時。加三氯乙酸去除蛋白質的原理：蛋白質在酸性條件下帶正電荷，與三氯乙酸的酸根結合形成沉淀[7～9]。

3.4實驗過程中需要注意加濃硫酸時，要充分搖勻，至顏色穩定（15min）后進行測定。實驗證明本法簡便，重現性好，測定結果在2h內穩定。

3.5本實驗通過對桑葉，桑枝，桑椹的含糖量的測定，表明桑椹中多糖的含量最高，其次為桑葉，桑枝較少。

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編輯/王海靜