納米銀對牙本質表面糞腸球菌生物膜的殺菌作用

摘要：目的 就納米銀對牙本質表面糞腸球菌生物膜的殺菌作用進行探討。方法 收集80顆無齲壞、完整無缺的前磨牙，將其制成309個牙本質片，隨機分為A組（納米銀組）、B組（次氯酸鈉組）、C組（氯化鈉組），每組有103個樣本。活菌菌落計數法檢測糞腸球菌生物膜活菌數，糞腸球菌生物膜的內層活菌、中間層活菌、外層活菌百分比用激光共聚焦顯微鏡來進行觀察。結果隨著0.1%納米銀溶液的處理時間的延長，糞場球菌生物膜活菌的數量呈現出較為明顯的降低趨勢，到24h之后就沒有活菌出現在生物膜內。與此同時，生物膜內層、中間層、外層活菌的平均厚度、百分比逐漸減少。結論 對于糞腸球菌生物膜而言，含量為0.1%的納米銀溶液有著較強的殺菌作用和滲透能力，能夠隨著處理時間的延長而讓殺菌作用增強，最佳的作用時間為處理24h以上。

關鍵詞：納米銀；牙本質表面；糞腸球菌生物膜；殺菌作用

從目前來看，再感染根管中最常檢測到的細菌為糞腸球菌，它也是主要的致病菌。在這種情況下，尋找出一種有效、安全的抗菌劑，是提高根管治療成功率的重要途徑之一。而納米銀的生物安全性良好、抗菌性能較強，特別適用于作為新型抗菌劑[1]。本文就納米銀對牙本質表面糞腸球菌生物膜的殺菌作用進行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實驗菌株 選擇由廣東省微生物研究所提供的糞腸球菌。

1.1.2主要實驗試劑 心腦浸出液培養基、含量為5.25%次氯酸鈉溶液、含量為0.1%納米銀溶液、含量為0.9%氯化鈉溶液。

1.1.3主要實驗儀器：FV500-IX81激光共聚焦顯微鏡、B3510E-DTH超聲清洗器、11-1280-250型切片機、JSM-6330E場發射掃描電鏡、LI20-2恒溫培養箱、厭氧罐。

1.2方法

1.2.1牙本質片的制備及分組 收集80顆無齲壞、完整無缺的前磨牙，將其制成309個牙本質片，隨機分為A組（納米銀組）、B組（次氯酸鈉組）、C組（氯化鈉組），每組有103個樣本。樣本經超聲清洗、滅菌之后保存在無菌PBS緩沖液內，保存溫度控制在4℃。

1.2.2構建牙本質表面糞腸球菌生物膜：復蘇糞腸球菌后，將其放置在BHI液體培養基中進行培養，培養溫度控制在37℃，培養時間控制在16h。菌懸液用BHI液體培養基來調整到1×107CFU/ml，按每孔2ml加到24孔板內，每孔1個樣本。

1.2.3糞腸球菌生物膜的表面形態進行掃描電鏡觀察：將A、B、C組樣本都進行24h培養，然后從其0h小組中隨機取3個樣本，將這些樣板上沒有黏附的細菌用雙蒸水清洗2次以上，再進行固定制樣，以此觀察糞腸球菌生物膜的表面形態。

1.2.4活菌菌落計數法檢測糞腸球菌生物膜活菌數 分別采用含量為5.25%次氯酸鈉溶液、含量為0.1%納米銀溶液、含量為0.9%氯化鈉溶液對樣本進行處理，在處理之前的1、6、12、24h時分別從三組中各取10個樣本，雙蒸水清洗2次，然后再將其放入無菌PBS的試管中，培養48h后菌落計數。

1.2.5糞腸球菌生物膜的內層活菌、中間層活菌、外層活菌百分比用激光共聚焦顯微鏡來進行觀察。

2 結果

隨著0.1%納米銀溶液的處理時間的延長，糞場球菌生物膜活菌的數量呈現出較為明顯的降低趨勢，到24h之后就沒有活菌出現在生物膜內。與此同時，生物膜內層、中間層、外層活菌的平均厚度、百分比逐漸減少。生物膜結構被含量為0.1%納米銀溶液處理1h之后，并沒有完全解體，但生物膜內層活菌百分比降至（20.8%±4.5%），中間層活菌百分比降至（27.4%±5.6%）；在處理6h之后，生物膜內層活菌百分比降至（1.8%±0.9%），中間層活菌百分比降至（2.0%±0.9%）。0.1%納米銀溶液處理12h、24h，生物膜各層活菌百分比與1.313%次氯酸鈉溶液組差異無統計學意義（P>0.05），但是都要明顯低于0.9%氯化鈉溶液組，存在著統計學意義（P<0.05）。

3 討論

隨著根管消毒方法及根管預備器械的快速發展，根管治療得到了迅速的提高，但整體成功率仍然只能達到85%～90%，主要原因在于治療后會出現繼發性根管內感染或者持續性根管內感染，而主要因素在于糞腸球菌的影響。糞腸球菌生物膜表面形態在掃描電鏡下可以明顯看到：在牙本質表面黏附了大量的糞腸球菌，胞外基質包裹住了糞腸球菌，并且相互聚集、相互連接，在孔隙、管道等處形成微菌落[2-3]。

納米銀的抗菌機制與其能夠將細菌的核酸、蛋白質予以破壞等有關。納米銀通過對肽聚糖的生物合成進行干擾，以此來對胞壁合成進行阻礙，并且還會緊密地結合細菌胞膜蛋白質，使得細胞內物質出現外滲現象，還可與細菌DNA堿基進行結合而導致DNA變性；在水溶液中，納米銀還可以形成Ag+來將關鍵酶進行失活代謝，并且形成過氧離子、氫氧自由基、過氧化氫而發揮出較為明顯的殺菌作用。總之，對于糞腸球菌生物膜而言，含量為0.1%的納米銀溶液有著較強的殺菌作用和滲透能力，能夠隨著處理時間的延長而讓殺菌作用增強，最佳的作用時間為處理24h以上。

參考文獻：

[1]Zhou HY，Zhang J，Yan RL，et al.Improving the antibacterial property of porcine small intestinal submucosa by nano-silver supplementation：a promising biological material to address the need for contaminated defect repair[J].Annals of Surgery，2011，21（11）：141-145.

[2]閆培芳，姜云濤，梁景平，等.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察堿性環境對糞腸球菌生物膜的影響[J].牙體牙髓牙周病學雜志，2011，18（12）：109-113.

[3]莊沛林，高燕，凌均棨，等.三種無機納米抗菌劑對糞腸球菌的抗菌作用[J].牙體牙髓牙周病學雜志，2011，20（12）：111-114.編輯/金昊天