成年大鼠三叉神經中腦核神經元內PV和NKCC1、KCC2的共存研究

摘要：目的 觀察PV，NKCC1和KCC2在成年大鼠三叉神經中腦核（Vme）神經元內的表達。方法 成年SD大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，取腦，冷凍切片，PV，NKCC1和KCC2在Vme神經元在小腦的免疫熒光雙標，免疫熒光顯微鏡觀察。結果 成年大鼠Vme神經元上能觀察到PV和NKCC1陽性神經元的表達，但在Vme神經元內幾乎觀察不到KCC2 的陽性熒光信號。結論 NKCC1與PV的共存率很高，而KCC2幾乎沒有表達。

關鍵詞：KCC2；NKCC1；小白蛋白；三叉神經中腦核；大鼠

陽離子-氯離子共轉運體在維持細胞內外Cl-濃度的平衡方面發揮主要作用。在目前報道的七種陽離子-Cl- 共轉運體中，神經系統內僅表達KCC1、KCC2、KCC3和NKCC1四種陽離子-Cl-共轉運體。其中，KCC2負責將神經元內Cl-向外轉運，而NKCC1則負責將胞外的Cl-向胞內轉運，二者在神經元胞膜上構成一對平衡體，從而維持神經元內Cl-濃度的穩定和平衡[1～5]。小白蛋白（Parvabumin， PV）是鈣結合蛋白的一種。有研究表明：發育過程中，PV特異性地表達于本體感覺初級傳入神經元胞體和突起上。目前，人們已將PV作為本體感覺初級傳入神經元的特異性標志物，并被廣泛應用于神經系統的發育學研究領域[6]。

1 材料與方法

1.1實驗動物和切片制備 雄性SD大鼠，體質量230～250g。動物用10%水合氯醛麻醉（0.3～0.5ml/100g），開胸經升主動脈向心插管，先灌注100ml生理鹽水隨后以4%冷多聚甲醛（0.1mol/L磷酸緩沖液配制，pH7.4）灌注固定，取整腦后固定6 h，15%和30%蔗糖各12h，30 m冰凍切片，收取含小腦的切片于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）。

1.2免疫熒光化學反應 參照我們以前的方法，主要步驟為：冰凍切片使用5%的正常羊血清室溫孵育30min；第一抗體為兔抗KCC2的多克隆抗體（1：200，Upstate），兔抗NKCC1的多克隆抗體（1：200，Sigma），鼠抗Anti-TH的單克隆抗體（1：200，Sigma）和鼠抗PV的單克隆抗體（1：200，Santa Cruz公司）4℃孵育48h；第二抗體為驢抗鼠（Rhodamine標記，Rockson公司，1：200）或驢抗兔（FITC標記，Sigma，1：200）的熒光標記二抗，在二抗孵育時加入DAPI藍色熒光染料（1：40，Sigma）室溫孵育2 h；PBS洗片，貼片，甘油封片，4℃保存備觀察。

2 結果

成年大鼠Vme 神經元內能觀察到較強的NKCC1陽性神經元（見圖A），Vme神經元上能觀察到PV陽性神經元（見圖B），但在Vme神經元內幾乎觀察不到KCC2 的陽性熒光信號（見圖C）。

圖Vme內PV，NKCC1和KCC2的表達 A：Vme內NKCC1的陽性表達，B：Vme內PV的陽性表達， C：Vme內KCC2幾乎觀察不到表達，Bar=50m。

3 討論

鉀離子氯離子共轉運體-2（KCC2）是哺乳動物腦內神經元的特異性標志物，也是介導神經元氯離子外排并維持神經元胞內低氯離子濃度的重要因素，而細胞膜內外的氯離子的濃度梯度則是GABA離子型受體賴以發揮抑制性作用的前提[7]，因此，KCC2也是離子型GABA受體介導抑制性作用的標志；在成年大鼠腦內，Vme沒有KCC2表達，同樣缺少離子型GABA受體介導的抑制性信號系統。陽離子-Cl- 共轉運體（NKCC1和KCC2）在成年Vme神經元的失衡表達導致Vme神經元胞內氯離子濃度隨發育不斷增高，氯離子通道（GABAA受體）開放后，氯離子外流導致去極化發生。但是，NKCC1、KCC2與PV在Vme的生后發育過程中是否有共存，其共存的比例是否有變化，而這種相對量上的變化與蛋白表達水平改變的實際情況是否相符也無明確的答案。

參考文獻：

[1]Delpire E， Rauchman MI， Beier DR， et al.Molecular cloning and chromosome localization of a putative basolateral Na（+）-K（+）-2Cl- cotransporter from mouse inner medullary collecting duct （mIMCD-3） cells[J].J Biol Chem，1994，269（41）：25677-25683.

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[4]Plotkin MD KM， Peterson LN. Expression of the Na+-K+-2Cl cotransporter BSC2.[J].Am J Physiol，1997，272（C173-C183.

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編輯/成森