替格瑞洛對ox—LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞vWF表達的影響

摘要：目的 探討不同濃度的替格瑞洛（Tigeralor）對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）血管性假血友病因子（vWF）表達的影響。方法 離體培養人臍靜脈內皮細胞，以1×10/ml接種于6孔培養板，200ul/孔，待細胞生長到融合狀態時取三孔加人ox-LDL （50ug/m1），處理24h后分別加入不同濃度的替格瑞洛（0、20及40umol/L）再作用24h。然后采用Western Blot法測定vWF的蛋白表達水平。結果 ox-LDL可增加vWF的蛋白表達；替格瑞洛可抑制ox-LDL誘導的HUVECs vWF的蛋白表達，并呈濃度依賴性。

關鍵詞：氧化型低密度脂蛋白；替格瑞洛；血管性假血友病因子；血管內皮細胞；人臍靜脈內皮細胞

已有研究表明，血管內皮細胞（vascular endothelial cell， VEC）的損失及功能紊亂與多種疾病密切相關，包括冠心病、高血壓、腦卒中、糖尿病等[1]。目前vWF被認為是反映VEC功能的最好指標[2]。ox-LDL可造成內皮細胞炎癥損傷，引起vWF高表達。替格瑞洛（Ticagrelor）是一種新型抗血小板藥物，在它發揮抗血小板作痛的同時，是否還具有改善血管內皮功能的作用，本研究將進行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1細胞 人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由天津市心血管疾病研究所贈與，培養基為含有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM-F12。

1.1.2主要試劑 DMEM-12培養基，GIBC，美國；FBS，Hyclone，美國；替格瑞洛原粉，上海鉑力生物科技有限公司，上海；vWF抗體，北京中原領先科技有限公司；氧化型低密度脂蛋白，北京欣源佳和生物科技有限公司；ImmobilonTM Western chmiuminescent HRP，MILLIPORE，USA；鼠抗ICAM-1單抗，北京中山金橋，北京；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG，Abcam，USA；鼠抗GAPDH單克隆IgG，Abcam，USA。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司，江蘇；Eppendorf低溫離心機，eppendorf，德國；細胞培養箱，Thermo Forma，USA；6孔培養板，Corning，USA；微量移液管，Brand accu-jet，USA；紫外可見光分光光度計，Eppendrof，USA；電子天平，北京多賽斯儀器系統有限公司；電轉膜儀，Becton，Dickinson and Company， USA；水平搖床，Becton，Dickinson and Company，USA。

1.2方法

1.2.1 HUVECs的培養及處理 對凍存的HUVECs株進行復蘇及傳代，置于37℃、5%CO2的培養箱內培養，第3～5代用于實驗。待細胞傳代培養2～3代后，將狀態良好的細胞平均分裝于6孔板內，于培養箱內繼續培養，待6孔板細胞生長到融合狀態時，加入ox-LDL及替格瑞洛進行刺激和干預。分組如下：1組：培養基1ml，替格瑞洛0；2組：培養基1ml，替格瑞洛20ul（20umol/ml）；3組：培養基1ml，替格瑞洛40ul（40umol/ml）；4組：培養基1ml，oxLDL38ul（50ug/ml），替格瑞洛0；5組：培養基1ml，oxLDL38ul（50ug/ml），替格瑞洛20ul（20umol/ml）；6組：培養基1ml，oxLDL38ul（50ug/ml），替格瑞洛40ul（40umol/ml）。其中1～3組為非ox-LDL誘導組，4～6組為ox-LDL誘導組。將六孔板置于恒溫37℃、5%CO2濃度培養箱內培養繼續培養24h。

1.2.2蛋白定量及分析 細胞經過刺激干預24h后，提取蛋白，采用WesternBlot進行蛋白定量經電泳、轉膜、封閉、孵育、曝光后獲得膠片，膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統對目的條帶和GAPDH（持家基因內參）條帶進行攝像，測量條帶的灰度值；比較各組件校正后的蛋白條帶灰度值的關系，并以未經刺激干預組為標準值，計算各組條帶的相對灰度值并繪制柱狀圖（圖1）。

1.3數據統計 采用SPSS17.0軟件，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05認為有統計學意義。

2 結果

WesternBlot蛋白定量結果顯示（圖1），ox-LDL誘導組vWF的蛋白表達明顯高于對應的非誘導組（P<0.05）；未予替格瑞洛干預組vWF的蛋白表達高于替格瑞洛低濃度組（P<0.05），替格瑞洛低濃度組vWF的蛋白表達高于替格瑞洛高濃度組（P<0.05）。

實驗分組

Vwf

GAPDH

圖1 vWF的蛋白表達

3 討論

近年來研究發現，內皮細胞功能失調是心腦血管疾病和糖尿病血管病變發病共同的始動環節之一。在動脈粥樣硬化發病機制中，內皮細胞損傷及內皮細胞所產生的NO、vwF、ET等對疾病的發生、發展起著重要的作用[3]，抑制這些因子的釋放可有效延緩動脈粥樣硬化的進展。內皮細胞參與體內多種重要的平衡調節及細胞功能調控，既作為各種外界刺激和體液介質的靶細胞，本身又具有非?；钴S的代謝功能，通過分泌多種活性物質維持血管的舒縮狀態，調節器官血流的同時對血液凝固、白細胞活性及血小板聚集在臟器的缺血、炎癥、免疫等反應過程中具有重要作用。vWF是VEC和巨核細胞分泌的、在正常凝血過程中發揮重要功能的一種多聚體糖蛋白，貯存在VEC的Weibel palade小體中，其多聚化程度的精確調控對維持正常的生理作用十分重要。當VEC活化或損傷時，將vWF釋放進人血中，由于vWF幾乎僅由血管內皮細胞產生，因此該指標水平的變化可敏感反映內皮細胞損傷、異常活化或功能障礙的存在。在病理情況下，vWF不但參與高凝狀態的形成，同時各類病理因素對于血管內皮的復雜影響也最終反映在血漿中vWF的水平變化上，所以vWF水平與病情發展趨勢密切相關，而這一特點對于臨床監測與評估尤為重要。

本研究顯示：ox-LDL可誘導HUVECs vWF的表達，替格瑞洛可抑制ox-LDL誘導的HUVECs vWF的表達，且呈濃度依賴性。替格瑞洛在發揮抗血小板作用的同時，能夠抑制vWF的表達，具有改善血管內皮功能的作用，進而延緩動脈粥樣硬化的進展，可能改善患者預后，為臨床提供新的思路。

參考文獻：

[1]Widlansky ME， Gokce N， Keaney JF， et a1. The clinical implications of endothelial dysfunction[J]. J Am Coll Cardiol， 2003， 42： l149-1160.

[2]Gautam N，Herwald H，Hedpxist P，et a1.Signaling vk beta（2）integrins triggers neutrophil-dependent alteration it endothelial barrier function [J].J Exp Med，2000，191（11）：1829.

[3]Whincup PH，Daner HJ，Walker M，et a1.Von willebrand factor and eoronary heart disease：prospective study and meta-analysis[J].Eur Heart J，2002；23（22）：1764-1770.

編輯/哈濤