XAGE—1b基因在肝癌細胞中表達的研究

摘要：目的 研究肝癌細胞中XAGE-1b基因的表達。方法 以64例肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織為研究對象，通過Real-timePCR法進行檢測和分析。結果 XAGE-1b基因在肝癌組織與在癌旁組織中表達值比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 XAGE-1b可作為肝癌診斷的標記物，建議與AFP檢測聯合應用。

關鍵詞：肝癌；XAGE-1b；PCR；表達

Abstract：Objective To study the expression of XAGE-1b in hepatoma cancer.Methods Take the cancerous tissue and para-cancer tissue in 64 cases of PHC as the research objects，employ the method of real time quantified PCR to study the expression of XAGE-b in PHC.Results The expression of PHC was higher than in para-cancer tissue （P<0.05）.Conclusion XAGE-1b may serve a valuable target in monitoring of PHC，suggest that XAGE-1b work together with AFP will be better.

Key words：Hepatoma cancer； XAGE-1b；Expression

原發性肝癌（PHC）病情危重，發病率較高，目前關于該病的病因和發病機制尚未明確，普遍認為與肝硬化、病毒性肝炎和黃曲霉素等致癌物質、環境因素有關，患者表現有肝區疼痛，消瘦乏力，食欲不振等癥狀，而近年來針對原發性肝癌研發了多種治療的新技術和新方法，但仍有60%左右的患者會出現復發和轉移，以往肝癌檢查都是采用肝癌學前標記物如AFP檢測，或者影像學檢查，存在一定的不足之處，本實驗旨在通過RT-PCR法分析XAGE-1b在肝癌細胞中的表達情況，來確定XAGE-1b能否作為PHC診斷及預后的依據。

1資料與方法

1.1儀器與試劑 熒光實時定量PCR反應儀：Ftc-2000（上海楓嶺生物技術公司）；微量移液器（Gilson公司）；離心機（Eppendorf5415D）；凝膠成像分析儀（上海復日公司）；石蠟切片機（RM2145，LEICA公司）；試劑盒（上海近岸科技有限公司），逆轉錄試劑盒（廣州泛思生物技術科技有限公司）；普通PCR反應試劑（包括Tap酶、dNTP，Buffer等）（上海申能博采公司）。TaqMan-MGB熒光探針及其相應的PCR反應引物（上?；瞪锛夹g公司）。

1.2標本來源 2010年10月～2014年10月江蘇大學附屬醫院收治的病理證實為原發性肝癌患者共64例，其中男38例，女26例，年齡34～72歲，分別取手術切除30 min內的癌組織和癌旁組織（距肝癌組織>1 cm）為樣本，置于預裝RNAlater保存液的凍存管中，封口編號備用。

1.3實驗步驟 按傳統一步法提取組織樣本中的總RNA，以12%瓊脂糖凝膠電泳抽樣檢驗其質量。提取出RNA后使用反轉錄試劑盒制備cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應，以GAPDH為內參基因。總反應體系20 μL，其中探針（20 mmol/L）0.5 μL，引物（20 mmol/L）0.9 μL，Mix10 μL（PCR試劑盒，日本TOYOBO公司），標本組織cDNA2 μL，H20補至20 μL，每個樣品的目的基因與內參基因各設3個重復實驗。XAGE-1b與GAPDH分別在相應的反應條件下進行PCR檢測。每次反應均設置空白對照組及用于繪制標準曲線的6個梯度的標準樣品反應混合物，標準樣品反應混合物由復旦大學病毒與分子免疫學實驗室制備提供。PCR反應結束后，計算機自動獲取標本中XAGE-1b和GAPDH的Ct值，對照標準曲線計算每個樣本XAGE-1b和GAPDH基因的拷貝數。結果以XAGE-1b和GAPDH基因拷貝數的比值表示相對表達量。

1.4統計學方法 應用SPSS 18.0統計學軟件，采用χ2檢驗或秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

抽提RNA檢驗結果見圖1，在16s sRNA和28s sRNA條帶明亮、清晰，證明所得樣品質量優良。自64例肝癌組織和癌旁組織抽提的RNA經PCR檢測，結果顯示肝癌組織表達量為2015×105，高于癌旁組織的表達量147×105，兩組比較存在顯著性差異（P<0.05）。XAGE-1b基因表達與患者的年齡、性別無相關性（P>0.05），見表1。

3討論

肝癌屬于在世界范圍內發病率較高的惡性腫瘤，對人民的身心健康危害嚴重。由于肝癌早期的癥狀并不確切，而癥狀明顯時已發展為中晚期肝癌，因而臨床醫師們針對肝癌的早期診斷展開長期的實驗研究。肝癌患者確診后可以通過外科手術或者化療等手段進行治療，目前已取得一定的成績，但值得一提的是很多肝癌患者會出現癌細胞的復發和轉移，為了改善肝癌患者的預后也應及早診斷和發現轉移。自20世紀以來分子生物學技術得到長足的發展，加上人類基因組計劃的支持，使得臨床工作者得以通過對肝癌細胞記憶的分析來探索更加靈敏和準確的腫瘤標記物，達到早期診斷的目的， 借助于腫瘤標志物的檢測結果可以進行針對性化療，降低非必要的化療引起的毒副作用。

到目前為止臨床中應用過多種腫瘤標志物如CEA、AFP、AFU等來診斷PHC，這些標志物各有其優勢和不足，國內外專家近年來對XAGE-1b基因進行了深入研究，并且獲得了XAGE-1b在腫瘤中較為詳細的表達譜[1]。經證實XAGE-1b基因在肺癌、前列腺癌的癌組織中表達率較高，并且與腫瘤亞型和分期有一定的關聯，郭成等研究了四類XAGE-1異構體在肝癌中的表達情況，結果顯示XAGE-1b基因在肝癌組織中大量表達。目前由于缺少大樣本的實驗和長期隨訪，關于XAGE-1b在PHC中表達的研究仍處于小范圍和小樣本的初期階段，其檢測結果的局限性在所難免，而且XAGE-1b能夠區分腫瘤細胞與非腫瘤細胞，良性與惡性腫瘤，但是難以區分具體的組織來源或病理類型的腫瘤，因此建議與AFP等腫瘤標志物檢測相結合，通過綜合分析進行研究，對于提高肝癌的確診率有積極的促進作用[2]。

RT-PCR方法具有檢測時間短（<3 h），特異性和敏感性高的特點，可以從復雜的樣品中檢測出微量的目標核酸，目前證實可用于淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體的定量測定[3]。定量PCR的應用可了解微轉移瘤細胞的數量，通過數量的變化可以觀察輔助治療的療效，從而為臨床篩選化療藥物及治療方法提供依據，鑒于以上優點，該技術已廣泛應用于臨床診斷。缺點是存在假陽性風險，操作過程中需要注意的是嚴格的無菌環境和防止mRNA的降解[4]。本研究證實了XAGE-1基因在肝癌的診斷中能夠較好地反映腫瘤細胞的播散程度，敏感性和特異性良好，為治療方法的選擇和療效的評價提供依據，改變肝癌篩選的傳統方法，顯著改善肝癌的及早發現和診斷，提高肝癌患者的生存率和生活質量。

參考文獻：

[1]吳濤，李中文，鮑明升.XAGE-1b基因在肝癌細胞中的表達[J].求醫問藥（下半月），2013，（06）.

[2]朱江，江福能，戴奇山，等.肝癌細胞中XAGE-1b的表達和意義[J].中國現代醫學雜志，2012，（20）.

[3]JI Y，ZHANG W，WANG J，et al.mRNA expression of the XAGE-1b gene in human acute leukemia[J].Int J Hematol，2010，91（2）：209-212.

[4]Tureci O，Sahin U，Vollmar E，et al.Human carbonic anhydrase XII：cDNA cloning，expression，and chromosomal localization of a carbonic anhydrase gene that is overexpressed in some renal cell cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America[C]. 1998.編輯/張燕