醫(yī)用納米銀材料的遺傳毒理學研究

摘要：隨著納米科技的迅速發(fā)展和納米材料的廣泛應用，人們對各種納米材料和納米顆粒的接觸與暴露機會也日益增加。納米銀作為應用最為廣泛的納米材料，其產(chǎn)品的生物安全性如何尚無定論。本文就近年國內(nèi)外最新的研究發(fā)現(xiàn)，對納米銀體內(nèi)外遺傳毒性以及其可能的機制作一介紹。

關鍵詞：納米銀；評價方法；遺傳毒性；毒性機制

納米銀是 21 世紀新型的抗菌劑研究開發(fā)最為廣泛的一種。納米銀材料包括單純納米級的銀（Ag）單質(zhì)顆粒組成的材料，以及銀離子（Ag+）附載于納米級的載體上而成的材料。因其具有獨特的抗菌性能，被廣泛的應用于醫(yī)療保健、食品、化妝品等領域。在我國國產(chǎn)的納米生物材料類醫(yī)療器械的注冊記錄中，2002～2006年間，按照類醫(yī)療器械曾得到批準注冊的標稱含納米銀的抗菌系列產(chǎn)品約占56%，有近百件之多。美國FDA也以a類醫(yī)療器械（510K批號）批準了一部分含銀的敷料類產(chǎn)品及其他納米技術相關產(chǎn)品，如骨填充修復材料，支架導管類的納米涂層產(chǎn)品等[1]。

隨著人們對納米銀的需求日益增加，而納米銀工業(yè)或家用產(chǎn)品對人類、動物、植物的負面生物學效應尚不完全清楚。有研究提示納米銀粒子在細胞、亞細胞、分子生物學水平如基因和蛋白水平等具有一定毒性效應。而目前絕大多數(shù)納米銀毒性的研究以細胞培養(yǎng)和急性毒性研究為主，對于納米銀作用于動物和人類細胞系的遺傳毒性的研究資料相對較少，本文主要對納米銀的遺傳毒理學研究現(xiàn)狀做一綜述。

1納米銀遺傳毒性的評價方法

研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的納米銀具有一定潛在的遺傳毒性，傳統(tǒng)的檢測遺傳毒性的方法是否適用于檢測納米銀還沒有定論，而納米銀遺傳毒性的相關報道也非常有限。現(xiàn)有的評價遺傳毒性的方法主要有沙門氏菌致突變試驗（Ame's test）、微核試驗和彗星試驗。有分析顯示體外的微核試驗和艾姆斯氏實驗可以完成嚙齒類動物的致癌物和活體遺傳毒的評 價[2]。

艾姆斯氏試驗通常為評價化學遺傳毒性的首選。研究表明直徑為5 nm的納米銀在艾姆斯氏試驗中呈陰性或弱陽性，陰性結果的產(chǎn)生可能是由于納米材料無法滲透入細胞壁，不可溶的粒子通過吞噬作用進入細胞，細菌的細胞壁無法完成此項功能致使納米銀粒子無法進入細菌的細胞內(nèi)部損傷DNA或引發(fā)突變，而艾姆斯氏試驗顯示弱陽性可能是由于粒子的可溶性[3]。另外納米銀粒子的聚集可使粒子體積過大從而無法通過細菌細胞壁的孔徑。納米粒子艾姆斯氏試驗陰性還可能因為測試的菌株對氧化DNA損傷不敏感。艾姆斯氏試驗中另一混雜因素就是試驗樣品的抗菌性，納米銀正是由于這一抗菌性才被廣泛的應用于各種產(chǎn)品，納米銀固有的毒性可能會導致實驗的敏感性降低。因此混雜了物理性質(zhì)、一般毒性和遺傳毒性的納米銀粒子可能會導致艾姆斯氏試驗的假陽性從而低估其致突變的能力。因此艾姆斯氏實驗并不適用于評價納米粒子的遺傳毒性。

相比之下，體外的彗星試驗和微核試驗比細菌中的艾姆斯氏試驗更為敏感，研究表明彗星試驗和細胞分裂阻滯微核試驗證明納米銀可以導致DNA損傷，表現(xiàn)為線粒體功能下降，氧化應激產(chǎn)生，細胞周期中斷等。彗星試驗和微核試驗顯示納米銀引起的DNA損傷有劑量依賴性，研究表明納米粒子在哺乳動物細胞系的彗星試驗呈陽性，但在艾姆斯氏試驗中呈陰性[4]。在微核試驗中，有報道發(fā)現(xiàn)納米銀是純金屬粒子不容易被S9混合物（大鼠肝勻漿）代謝，而S9混合物會形成膠團或覆蓋納米銀粒子而可能影響納米銀的微核試驗結果。有報道比對了S9混合物加入與否對微核試驗和微核阻滯試驗的結果的影響，發(fā)現(xiàn)S9混合物對兩個試驗結果并無影響[5]。

由此我們認為在艾姆斯氏試驗中納米銀不能引起突變，而在彗星實驗和微核試驗中納米銀的遺傳毒性呈劑量依賴性，提示在體外實驗中彗星實驗和微核試驗比艾姆斯氏試驗更適用于評價納米銀的遺傳毒性。而隨著實驗技術的發(fā)展，在研究納米銀的遺傳毒性實驗中更應該注重粒子的不同性質(zhì)如尺寸、形狀和攝取機制等。

2納米銀的體外遺傳毒性

許多體外試驗從各個不同角度，通過多種體外遺傳毒性實驗方法（如Ames試驗、微核試驗、染色體畸變分析以及彗星試驗等），提示一定劑量的納米銀對多種動物來源的細胞均有潛在遺傳毒性，包括小鼠胚胎干細胞和成纖維細胞、小鼠生殖干細胞、BRL3A大鼠肝細胞、大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌細胞、幼地鼠腎細、虹鱒魚肝細胞、日本青鳉纖維母細胞、人肺成纖維細胞和人膠質(zhì)細胞瘤細胞、人皮膚癌細胞、人肝癌細胞株等[6]。

AshaRani等應用正常的人肺成纖維細胞（IMR-90）和人膠質(zhì)細胞瘤細胞（U251），對淀粉涂覆的銀納米顆粒（6～20 nm）的毒性進行研究發(fā)現(xiàn)，彗星試驗中400 μg/ml納米銀作用IMR-90和U251兩種細胞后DNA尾部明顯延長（18和6μm vs空白組3和1 μm），且呈劑量依賴性；胞質(zhì)分裂阻斷微核試驗發(fā)現(xiàn)200 μg/ml納米銀作用IMR-90和U251兩細胞后微核形成率明顯增加（14%和8%vs空白組3%和1%）。另外還發(fā)現(xiàn)納米銀劑量依賴性的損傷細胞線粒體并且增加活性氧簇的生成。TEM分析發(fā)現(xiàn)在線粒體和細胞核內(nèi)納米銀顆粒聚集，暗示其可能直接參與線粒體毒性和DNA損傷。推斷其產(chǎn)生毒性的一種可能機制是納米銀引起線粒體損傷，引起線粒體呼吸鏈斷裂，導致ROS的生成增加和ATP合成中止，最終導致DNA損傷[7]。Hackenberg等在利用人骨髓間充質(zhì)干細胞研究也提示了納米銀對DNA的損傷作用，在彗星試驗中發(fā)現(xiàn)0.1 μg/ml納米銀（100 nm）作用1 h即引起細胞DNA損傷，作用24 h后損傷明顯增強，同時還觀察到染色體異常[8]。

在納米銀對其他動物細胞的研究中，Ahamed等報道了納米銀引起鼠胚胎成纖維細胞和干細胞的細胞周期檢查點蛋白質(zhì)p53上調(diào)、DNA損傷修復蛋白Rad 51和DNA雙鏈斷裂標志物γ-H2AX表達增加[9]。

這些體外細胞試驗結果表明納米銀誘導多種動物細胞的活性氧生成和炎癥反應，直接或間接造成DNA損傷、細胞周期及有絲分裂遏止，導致染色體畸變，并呈時間和劑量依賴性，并且還發(fā)現(xiàn)其遺傳毒性強度與粒徑的大小、形狀、聚集狀態(tài)、顆粒表面的化學修飾及電荷有著重要的關聯(lián)性。提示納米銀具有一定的遺傳毒性風險。

3納米銀的體內(nèi)試驗遺傳毒性

體外遺傳毒性試驗作為評價物質(zhì)是否有遺傳毒性的初步方法，其特點是敏感性高，但是特異性低，易出現(xiàn)假陽性。因此，需要體內(nèi)遺傳毒性試驗進一步明確其遺傳毒性風險程度。

目前對于納米銀的遺傳毒性研究主要集中于體外研究，對于體內(nèi)特別是哺乳動物的遺傳毒性作用研究極少。Song等報道了雌性IRC小鼠單次腹腔注射納米銀（100 nm）48 h后，外周血網(wǎng)織紅細胞微核率升高，DNA鏈ROS損傷產(chǎn)物8-oxodG在尿中含量升高，而在骨髓和肝臟中未檢測到明顯變化，作者認為納米銀具其遺傳毒性并與氧化應激有關[10]。而Kovvuru等研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠連續(xù)5 d經(jīng)口給予30 nm納米銀500 mg/kg后，外周血和骨髓中微核發(fā)生率升高，γ-H2AX陽性細胞數(shù)增加以及外周血的8-oxoG水平升高，并且發(fā)現(xiàn)納米銀能夠影響DNA修復有關基因的表達，特別是明顯抑制了堿基切除修復基因的表達；同時對妊娠期C57BL/6J小鼠連續(xù)5 d經(jīng)口給予納米銀后，發(fā)現(xiàn)其胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)大片段DNA缺失。作者認為口服納米銀能夠引起基因組不可逆的改變[11]。

對于非哺乳動物模型的研究，如斑馬魚、虹鱒魚、貝類、底棲動物、果蠅等，也發(fā)現(xiàn)納米銀對其有遺傳毒性。在成年斑馬魚上發(fā)現(xiàn)納米銀能引起DNA損傷，γ-H2AX和p53表達增加[12]；少年虹鱒魚暴露于納米銀后引起脂質(zhì)過氧化（LOP），DNA鏈出現(xiàn)斷裂[13]。

然而對于納米銀的遺傳毒性研究也有不同的結論，如Kim等在SD大鼠的納米銀毒性研究試驗中，連續(xù)經(jīng)口暴露28 d后未觀察到嗜多染紅細胞微核發(fā)生率增加[14]；Kim等也報道了在SD大鼠連續(xù)吸入納米銀90 d后，與對照組相比同樣未觀察到嗜多染紅細胞微核發(fā)生率增加[15]。

對于在體內(nèi)遺傳毒性評價中得到完全相反的兩種結論，我們認為可能是主要是由于納米銀到達靶器官的濃度和作用時間不同引起的。由于納米銀經(jīng)消化道或呼吸道吸收進入體內(nèi)后，主要分布在局部組織（胃和肺） 、肝臟、腎臟、脾臟等，存在于血液及骨髓的量非常少，滯留時間短[1]。因此，對于納米銀體內(nèi)遺傳毒性的評價，應該增加敏感靶器官，進行更全面的科學評價。

4納米銀遺傳毒性的可能機制

目前，對于納米銀遺傳毒性的機制尚不完全清楚，一般認為納米銀可能通過兩條途徑導致DNA損傷：①納米銀顆粒能夠直接通過亞細胞膜，經(jīng)核孔進入細胞核內(nèi)并沉積，②通過TEM可以觀察到納米銀在人肺成纖維細胞細胞核內(nèi)沉積[14]，這些沉積的納米銀能夠與DNA和核蛋白結合，從而直接導致DNA鏈斷裂以及基因組重組。

另外，線粒體作為納米銀的毒性作用的敏感靶部位，納米銀進入細胞后，結合NAD（P）H氧化酶產(chǎn)生氧化自由基，引起線粒體線粒體功能障礙，ROS產(chǎn)生以及促凋亡蛋白從線粒體中釋放，從而引起DNA損傷和染色體畸變。通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)納米銀聚集在線粒體外，干擾線粒體依賴的jun-N激酶（JNK）途徑，引起人皮膚成纖維細胞、A549線粒體損傷，引起線粒體膜電位下降，膜通透性改變，導致氧化磷酸化系統(tǒng)解偶聯(lián)，引發(fā)線粒體呼吸鏈斷裂使活性氧生成增加，ATP耗竭，最終導致DNA損傷[16]。

此外，還有一些研究報道了納米銀能夠下調(diào)DNA的修復功能，特別是BER基因。BER基因在DNA氧化損傷修復中起重要作用，例如其中的Neil1、Neil3、Nthl1和Myh基因能夠切除氧化或錯配的DNA堿基，產(chǎn)生AP位點[17]，Myh基因缺陷的C57BL/6J小鼠對納米銀的敏感性更高，更易發(fā)生DNA損傷。

4結論

綜上，基于現(xiàn)有的研究，納米銀的遺傳毒性及其機制尚不完全清楚，還需不斷的深入研究。納米銀在健康保健、疾病治療中的應用方興未艾，還處于不斷的探索階段，隨著納米銀的廣泛應用，研究者在尋找納米銀最佳的應用劑量的同時亟需一個完善的納米銀毒性檢方案和相應的檢測標準，不但能保護人類生命健康和環(huán)境完整性，也為納米銀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展注入源源不斷的動力。

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