小鼠H22皮下移植肝腫瘤模型構建及干預效果與分子機制初探

摘要：目的 分析并探討雷氏蛛毒以及有氧運動對小鼠H22皮下移植肝腫瘤的應用效果，并分析其細胞的分子機制，以期為今后的肝癌治療方向提供一定的理論依據。方法 選取60只小鼠，采用皮下移植的方法構建出肝部腫瘤的模型，并將這些建模鼠平均分為模型組、雷氏蛛毒組以及有氧運動組，并在建模3d之后對其使用雷氏蛛毒注射以及有氧運動干預的方法。采用蘇木精-伊紅染色法測定三組小鼠的肝部腫瘤顯微結構；免疫組化方法測定小鼠腫瘤中突變型P53等蛋白水平的差異性；熒光定量技術檢測腫瘤野生型P53等信使核糖核酸的表達水平。結果 蘇木精-伊紅染色結果：模型組小鼠無組織壞死，雷氏蛛毒組出現較大壞死區，有氧運動組細胞排列不規則；免疫組化實驗檢測結果：雷氏蛛毒組陽性表達高于其他組，有氧運動組陽性表達最低；熒光定量檢測結果：雷氏蛛毒組及有氧運動組的凋亡抑制蛋白表達低于對照組。結論 雷氏蛛毒及有氧運動方法對H22肝部腫瘤具有抑制作用，并能降低突變型凋亡抑制蛋白以及信使核糖核酸的含量，提升野生型P53、P21基因以及相關蛋白的含量。

關鍵詞：皮下移植；肝部腫瘤；分子機制

肝部腫瘤是臨床中常見的惡性腫瘤之一，是我國的第二大癌癥，發病人數眾多，每年約有超過10萬人死于肝癌，其憑借高發病率、高死亡率等特點嚴重威脅人們的生命健康[1-3]。在這樣的背景下，應尋求一種有效的治療方法。在臨床中常見的治療方法有手術治療以及放療、化療等，但治療效果并不明顯。雷氏蛛毒及有氧運動對肝部腫瘤具有明顯的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇由北京華阜康生物科技股份有限公司培育的60只昆明小鼠為研究對象，將其平均分為模型組，雷氏蛛毒組以及有氧運動組，每組20只。在小鼠后頸部皮下注射0.2ml的H22肝部腫瘤細胞株懸液進行建模。

1.2 方法 雷氏蛛毒組：在建模成功3d后靜脈注射0.3ml的雷石柱毒素，連續注射20d；有氧運動組：建模3d后將小鼠放入30℃的溫水當中讓其進行有氧游泳訓練法，30min/d，1w訓練5d，一共訓練5w。

1.3實驗對象處理 在治療5w后將三組小鼠麻醉，采用頸椎脫臼的方法將小鼠處死并取出腫瘤組織和肝臟稱重。稱重后將其放置于10%的多聚甲醛溶液中固定15h，包裹石蠟制成組織切片，進行分子機制研究分析。

1.4實驗方法 ①蘇木精-伊紅染色法：將組織切片脫蠟脫水后使用蘇木精-伊紅染色，在光學顯微鏡下觀察肝部腫瘤組織結構；②免疫組化實驗法：使用免疫組織化學染色的方法檢測腫瘤組織的P53、P21等基因的表達；熒光定量PCR檢測法：提取小鼠20㎎的肝部腫瘤組織，并使用試劑盒提取出總的核糖核酸，使用焦碳酸二乙酯水將核糖核酸的濃度調到1 μg/μl 。最后將反應物放置在由海山富科學儀器有限公司生產的PCR儀器中，檢測三組小鼠肝部腫瘤的野生型P53、P21基因。

1.5統計學方法 本次研究當中的所有數據均采用SPSS13.0統計軟件對研究對象的相關數據進行處理，計數資料采用率（%）表示，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1一般結果 在建構模型的過程中，三組小鼠無死亡情況，腫瘤模型建構成功后，隨著腫瘤的生長，三組小鼠的食欲及精神狀態由最初的良好轉變為食欲不振、精神萎靡，但雷氏蛛毒組及有氧運動組小鼠情況優于模型組。

2.2 肝部腫瘤結構顯示結果 模型組的腫瘤細胞排列整齊，呈現圓形及橢圓形形狀，能觀察到大量的巨型腫瘤細胞，腫瘤的實質和間質模糊；雷氏蛛毒組：腫瘤細胞排列稀疏，細胞核大量壞死；有氧運動組腫瘤細胞排列稀疏，壞死區域明顯，細胞質呈現出空泡化的情況。

2.3 免疫組化對P53、P21基因的檢測結果 小鼠的肝部腫瘤突變型P53、P21、細胞凋亡基因以及凋亡抑制蛋白的表達在細胞核和細胞漿等位置，模型組的P53基因和凋亡抑制蛋白表達占42%，高于雷氏蛛毒組和有氧運動組的12%和18%；P21基因和細胞凋亡基因的表達中，雷氏蛛毒組和有氧運動組為37%和38%高于模型組的8%。三組對比具有統計學意義（P<0.05）。

2.4肝部腫瘤野生型分子機制表達 模型組小鼠肝部腫瘤野生型P53基因的信使核糖核酸表達量最低，數據為0.4和，雷氏蛛毒組的表達量為5.6，而有氧運動組的表達量為3.7，雷氏蛛毒組以及有氧運動組高于模型組，結果差異具有統計學意義（P<0.05）。而模型組、雷氏蛛毒組和有氧運動組的凋亡抑制蛋白的信使核糖核酸表達量為11.5、2.0、3.9，模型組高于其他兩組。

3 討論

肝部腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，因其具有潛伏期長、死亡率高等特點，成為了威脅人們生命健康的頭號殺手。在本次研究中，對60只昆明小鼠進行皮下移植法的肝部腫瘤建模，這種方法的優勢為不對小鼠的運動造成影響，并能明顯觀察出腫瘤的生長體積。

常見的臨床治療肝部腫瘤的方法為手術治療，但由于肝部腫瘤的早期癥狀不明顯，通常情況下患者就診即為晚期，腫瘤細胞已大量擴散，因此手術方法效果并不顯著。近些年來，在醫學領域中發現了雷氏蛛毒具有抑制腫瘤的作用，通過一系列的臨床研究表明，雷氏蛛毒能使肝部腫瘤的細胞周期發生變化，使S期細胞下降，因此雷氏蛛毒成為了新型的治療肝部腫瘤的方法。通過本文中的研究表明，三組小鼠中，模型組的腫瘤細胞排列整齊，呈現圓形及橢圓形形狀，能觀察到大量的巨型腫瘤細胞，腫瘤的實質和間質模糊；雷氏蛛毒組：腫瘤細胞排列稀疏，細胞核大量壞死；有氧運動組腫瘤細胞排列稀疏，壞死區域明顯，細胞質呈現出空泡化的情況。可見雷氏蛛毒及有氧運動對肝部腫瘤細胞的作用明顯。

而在肝部腫瘤分子機制的實驗研究中，小鼠的肝部腫瘤突變型P53、P21、細胞凋亡基因以及凋亡抑制蛋白的表達在細胞核和細胞漿等位置，模型組的P53基因和凋亡抑制蛋白表達占42%，高于雷氏蛛毒組和有氧運動組的12%和18%；P21基因和細胞凋亡基因的表達中，雷氏蛛毒組和有氧運動組為37%和38%高于模型組的8%；模型組小鼠肝部腫瘤野生型P53基因的信使核糖核酸表達量最低，數據為0.4和，雷氏蛛毒組的表達量為5.6，而有氧運動組的表達量為3.7，雷氏蛛毒組以及有氧運動組高于模型組，模型組、雷氏蛛毒組和有氧運動組的凋亡抑制蛋白的信使核糖核酸表達量為11.5、2.0、3.9，模型組高于其他兩組。

綜上所述，雷氏蛛毒及有氧運動方法對H22肝部腫瘤具有抑制作用，并能降低突變型凋亡抑制蛋白以及信使核糖核酸的含量，提升野生型P53、P21基因以及相關蛋白的含量。

參考文獻：

[1]凌柯，羅赤苗，張國華.小鼠H22皮下移植肝腫瘤模型構建及干預效果與分子機制初探[J].湖南師范大學學報（醫學版），2013，04（21）：11-15.

[2]朱敬生，陳嘉勤，陳薇薇.有氧運動聯合雷氏蛛毒對小鼠H22肝腫瘤的干預研究[J].武漢體育學院學報，2014，01（22）：96-100.

[3]朱敬生，王茂材，李林.有氧運動聯合雷氏蛛毒對小鼠H_（22）肝腫瘤的干預研究[D].湖南師范大學，2014.

編輯/蘇小梅