念珠菌對兩種抗真菌藥物的敏感性對比分析

摘要：目的 檢測念珠菌對2種抗真菌藥氟康唑、伊曲康唑的體外藥物敏感性，指導臨床選擇敏感的抗真菌藥物。方法 實驗受試菌株共40株，均來自于2013年1月～2014年11月我院皮膚科患者送檢的標本，均證實為念珠菌。用M27-A2法測試念珠菌對氟康唑、伊曲康唑的敏感性。結果 結果顯示氟康唑、伊曲康唑對念珠菌的敏感率分別為75.5%、67.5%。結論 氟康唑、伊曲康唑對念珠菌均具有較好的敏感性，本實驗結果顯示兩者無明顯差異，因氟康唑價格相對低廉，且對念珠菌的抗菌作用較好，仍可作為念珠菌感染的主要治療藥物。

關鍵詞：念珠菌；抗真菌藥；藥敏試驗

念珠菌屬一共含有163種菌種，存在于正常人的皮膚、呼吸道、消化道以及泌尿生殖道等部位，是人體的正常菌群，屬于條件致病菌。隨著廣譜抗生素的廣泛應用及寵物飼養量不斷增多，皮膚真菌病的發病率有逐年增多的趨勢。且病原菌感染的類型、致病病菌等，也呈現出明顯的地區差異[1]。對此，本文選擇最常用的M27-A2法進行對比，選擇的藥物為目前應用較多的氟康唑以及伊曲康唑，從念珠菌對兩種抗真菌藥的敏感性以及耐藥性的差異，為臨床念珠菌病（candidiasis）發現耐藥菌株以及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 所用40株受試菌株，均來自于2013年1月～2014年11月我院皮膚科患者送檢的標本臨床分離株。按常規方法及科瑪嘉念珠菌顯色培養基聯合進行菌株鑒定。以沙氏培養基4℃冰箱保存。質控菌株采用CLSI推薦的質控株。所選藥物均由廠家直接提供，所有藥物均在有效期內。

1.2方法 根據CLSL/NCCLS推薦的酵母微量稀釋法抗真菌藥物敏感試驗參考方案M27-A2[2]嚴格進行操作，對分離的念珠菌進行氟康唑、伊曲康唑敏感性試驗，方法如下。

1.2.1藥液的配置 實驗前，分別將配置好的貯存的藥液取出，置35℃溫箱孵化解凍。然后用稀釋液RPMI-1640（內含1%葡萄糖）進行倍比稀釋，三種藥液的配置如下：①氟康唑：取藥液先作1∶9稀釋，得到10倍終濃度（128 μg/ml），然后將藥液以2倍梯度倍比稀釋，得到10個梯度實驗濃度的藥液。氟康唑的終質量濃度范圍在0.125～64 μg/ml。②伊曲康唑：取藥液先作1∶9稀釋，得到10倍終濃度（160 μg/ml），再次作1∶9稀釋，得到10倍終濃度（16 μg/ml），然后將藥液以2倍梯度倍比稀釋，得到10個梯度實驗濃度的藥液。伊曲康唑的終質量濃度范圍為0.0313～16 μg/ml。

1.2.2受試藥敏板的制備 ①在無菌96微孔板中用加樣槍每行從第2～12孔每孔分別加入配置好的（1～5）×103CFU/ml二倍終濃度菌懸液100 μl；②從第2～11孔，每孔加入藥液100 μl，第1、2、3行的藥液分別為氟康唑、伊曲康唑，濃度按配置好的濃度范圍由高到低；③第12孔加不含藥的RPMI1640液基100 μl（作陽性對照）；④第1孔加入不含藥的RPMI1640液基200 μl（作陰性對照）。

1.2.3質控藥敏板的制備 方法同受試藥敏板。質控株MIC結果穩定，質控株包含在每一次藥敏試驗中。

1.2.4培養 將制備好的藥敏板加蓋后置35℃恒溫培養箱中進行孵育，培養48 h，進行結果判定。

1.3結果判定 評分標準：與生長對照孔相比肉眼觀察完全透明或未見生長為0分；霧狀混濁為1分（念珠菌80%生長受抑制）；濁度明顯降低為2分（念珠菌50%生長受抑制）；濁度輕度下降為3分；濁度未降低為4分。遇有團塊、顆粒形成時用吸打、混懸器等技術分離混勻。本試驗對Itraconazole、Fluconazole采取評分1分（即80%生長受抑制，肉眼觀察為霧狀混濁）為判定終點基準MIC。當藥物的MIC值超過或低于測定范圍時，按以下方法進行統計：當MIC值高于最高濃度64 μg/ml或16 μg/ml時，按≥64 μg/ml或≥8 μg/ml計算，記為耐藥；當MIC值為最低濃度以下時，則按≤0.03 μg/ml或≤0.0125 μg/ml計算，記為敏感。

1.4統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，采用χ2檢驗對兩種藥敏試驗方法進行對比分析。

2 結果

對于念珠菌對藥物的敏感性，本研究現采用M27-A2方案對臨床應用較早、價格相對低的氟康唑與近些年應用較廣的伊曲康唑作對比分析。念珠菌對兩種藥的敏感性實驗結果，見表1。

用SPSS對其進行χ2檢驗，χ2=0.600，P=0.438，P>0.05，表明兩種藥物對念珠菌的敏感性無明顯差異，對念珠菌而言兩者都是很好的抗菌藥物。這與有些文獻報道不符，考慮可能為樣本量小或地區念珠菌敏感性差異有關。

3 討論

本實驗分別采用M27-A2法，測定40株臨床分離念珠菌MIC值，試驗表明，大多數菌株對所測的唑類藥物是敏感的。氟康唑應用于念珠菌之間的體外藥敏試驗研究最多。NCCLS的判定折點為：MIC≤8 mg/L敏感，16～32 mg/L是中介性敏感（I），≥64 mg/L則為耐藥。本藥敏試驗結果顯示75.5%的念珠菌對氟康唑敏感性較好，低于部分文獻報道[3]，考慮可能與念珠菌的耐藥性增加相關，但是有研究報道藥敏試驗提示耐藥者仍有對治療反應良好的現象。伊曲康唑用于念珠菌的體外藥敏試驗的研究相對氟康唑較少。M27-A規定的判定折點為MIC≤0.125 mg/L為敏感，0.25～0.5 mg/L為S-DD，≥1 mg/L則為耐藥。MIC為S-DD和耐藥的菌株對伊曲康唑的反應差。

近幾年，由于念珠菌感染的發病率和耐藥率逐年增多，甚至較少見的頭癬也時常見到，它主要通過人與人、人與患病動物相互接觸而引發[4]。為了提高對真菌病的診斷和治療水平，臨床微生物實驗室需密切配合臨床，做好真菌的常規檢驗的同時，應積極開創和改進真菌藥敏試驗方法，氟康唑、伊曲康唑對念珠菌均具有較好的敏感性，本實驗結果顯示兩者無明顯差異，因氟康唑價格相對低廉，且對念珠菌的抗菌作用較好，仍可作為念珠菌感染的主要治療藥物。此外，臨床醫生也應提高對藥物敏感性測定的重要性認識，應用藥敏試驗，選擇敏感的藥物，減少耐藥菌的出現。

參考文獻：

[1]王迎林，陸祖萍，項彤，等.寧波地區淺部真菌病3637例致病菌的菌種分析[J].中國皮膚性病學雜志，2012，26（10）：900-901.

[2]王端禮.醫學真菌學實驗室檢驗指南[M].1版.北京：人民衛生出版社，2005：103-104.

[3]Brunella Posteraro，Rosa Martucci，Marilena La Sorda.Reliability of the Vitek 2 Yeast Susceptibility Test for Detection of In Vitro Resistance to Fluconazole and Voriconazole in Clinical Isolates of Candida albicans and Candida glabrata[J].Journal of Clinical Microbiology， 2009，47（6）：1927-1930.

[4]Ali，Rezaei-Matehkolaei Koichi，Makimura G Sybren，de Hoog Mohammad Reza，et al.Multilocus differentiation of the related dermatophytes Microsporum canis，Microsporum ferrugineum and Microsporum audouinii[J].Journal of medical microbiology，2012，61（Pt 1）：57-63.

編輯/羅茗柯