COPD患者外周骨骼肌萎縮中的功能性蛋白組學的研究

摘要：目的 對正常老年人、COPD患者無外周骨骼肌萎縮、COPD患者合并外周骨骼肌萎縮的蛋白電泳圖譜進行配對分析比較，尋找差異蛋白質點。方法 應用質譜鑒定技術，對差異蛋白質點進行鑒定。結論 經相關文獻檢索，分析所鑒定的蛋白質在COPD患者外周骨骼肌萎縮的關系，為今后新的治療靶點的研究奠定基礎。

關鍵詞：慢性阻塞性肺疾病；骨骼肌萎縮；蛋白質

近年來，慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的發病率和病死率正逐年增加，不是一種單純的肺部疾病，而是可以累及引起全身炎癥、心血管系統、消化系統、骨骼肌萎縮、骨質疏松等具有廣泛的肺外損傷的全身疾病，尤其是不明原因的骨骼肌萎縮和體重減輕及功能障礙[1]。分析與肌肉萎縮相關的關鍵蛋白質及其功能可能對治療具有重要的臨床指導意義。

1 資料與方法

1.1蛋白質取材 30例老年人，年齡均在70～90歲，無COPD組（正常組）10例，COPD患者無外周骨骼肌萎縮組（無萎縮組）10例，COPD患者存在外周骨骼肌萎縮組（萎縮組）10例，分別取髕骨上15cm股四頭肌的外側肌；所有肌肉樣品，在切取后立刻用冰的PBS沖洗，去掉組織中殘留的血液等，剪成碎片置于1.5ml Eppenderf管中，并儲存于-80℃。

1.2方法

1.2.1蛋白質的制備：將收集完的樣品，用電子天平稱取等重量樣品（50mg）用預冷的0.01 mol·L-1PBS：（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次，預冷的蒸餾水洗滌1次，出去渣滓，在液氮中制動研磨至粉末狀，加適量裂解液充分混勻，在4℃冰浴靜置15min，冰浴超聲、離心，后取上清，用bradford法測其標本的濃度，分別取樣本量1000μg均于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2雙向凝膠電泳、染色劑脫色：第一向等點聚焦：從冰箱中取出IPG（17mm PH3-10）預制膠條分成三組，經過與溶脹緩沖液充分混合、稀釋、過濾、蒸發制成膠條立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳。第二向SDS-PAGE電泳：拿出膠條放在平衡緩沖液Ⅰ中水平緩慢搖動平衡，再轉移至平衡緩沖液Ⅱ中水平緩慢搖動平衡等一系列處理后凝膠，進行染色、脫色。

1.2.3蛋白圖象采集與分析：染色、脫色完成后的雙向電泳凝膠，用凝膠圖像掃描儀透射掃描獲得圖像，發送圖象至ImageMaster的軟件分析程序進行下一步凝膠圖象的分析。蛋白質斑點檢測，調整峰值、邊緣以及利用子模式中的增刪、分割等找出代表同一蛋白質的點，以比較不同凝膠中的蛋白表達情況。

1.2.4膠內酶切和質譜分析：選擇雙向凝膠電泳匹配后找到的差異非常顯著的蛋白點自動匹配，將電泳后凝膠中差異非常顯著的蛋白點切出，反復清洗，脫色后的膠塊在真空離心干燥機內干燥，使膠塊完全脫水體積縮小成近似球狀，離心干燥。所有的PMF質譜圖MALDI-TOF-MS分析，通過PMF鑒定蛋白質可以根據分子量、等電點、肽段匹配數、尋找匹配的相關蛋白質。

1.3統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件包方差分析及顯著性t 檢驗。進行統計學處理，數據均用（x±s）表示，P值<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1蛋白質的濃度測定結果 經過Bradford法測得樣本蛋白質的濃度為，正常組8.31μg/μl，非萎縮組：10.61μg/μl，萎縮組9.54μg/μl。

2.2雙向凝膠電泳圖 見圖1。

2.3差異表達蛋白 根據蛋白點的面積、灰度值及光密度值等參數，用ImageMaster2D Platinum Software軟件對正常組、萎縮組、非萎縮組蛋白圖譜進行分析比較，發現COPD患者蛋白圖譜中有17個蛋白斑點表達量與正常組有顯著差異（差異為Vol%值上調或下調2倍以上），用胰蛋白酶消化后，進行MALDI-TOF-MS檢測，得到肽質量指紋譜。徑Mascot查詢SWISSPROT數據庫，結合2-DE凝膠上蛋白點的分子量和等電點，得分超過66分（P<0.05）將被認為是可靠鑒定的結果，其中有10個超過66分，推測功能性蛋白可能為烯醇酶-1，碳酸脫水酶（碳酸脫水酶Ⅲ），肌鈣蛋白T和幾種血紅蛋白。

3 討論

通過蛋白組學的方法比較正常組、非萎縮組、萎縮組的蛋白表達量的差異，本實驗研究結果發現幾個功能性蛋白表達量在三組中有著明顯的差異。以下將逐一詳細討論。

3.1烯醇酶-1（ENO1） 烯醇酶-1，是一種存在于肌肉等組織里的酶，在碳水化合物的新陳代謝中起著重要作用。在糖類的發酵、酵解中，此能量通過丙酮酸激酶的作用用于ATP的生成；還能與細胞骨架蛋白和多聚核苷酸結合[1-2]，是纖溶酶原、層粘連蛋白的受體等[3]，ENO1作為纖維蛋白溶酶原受體、纖維蛋白溶酶原結合蛋白，將纖維蛋白溶酶原結合于細胞周圍并促其活化，活化的纖維蛋白溶酶原發揮其蛋白水解酶的作用，激活纖溶酶其表達增加將使成肌細胞表面纖溶酶的產生增加。在本研實驗究中，我們發現無論是非萎縮組還是萎縮組表達量都是上調的；推測可能在患者在長期慢性缺氧時，出現有氧呼吸的ATP能量生成不足，使得烯醇酶-1表達量增加來促進ATP生成，這是與COPD患者氧通氣不足引起的無氧呼吸糖酵解是相吻合的；當缺氧進一步加重時，可能出現烯醇酶啟動纖溶酶系統開始分解骨骼肌肌纖維，來滿足能量的不足，進而引起骨骼肌纖維的減少，即發生骨骼肌的萎縮；國內外并未見有關于COPD患者骨骼肌蛋白酶在調節骨骼肌萎縮上報道，可能還存在其他途徑能使該蛋白酶在表達量上的變化，其具體途徑仍需要進一步的研究，分析該蛋白酶在調節骨骼肌蛋白分解及代謝上的分子機制。

3.2碳酸脫水酶Ⅲ（CAⅢ） 碳酸脫水酶Ⅲ是碳酸苷酶的一種，它們都具有共同的主要功能：①在血液及其他組織中維持酸堿平衡；②幫助體內組織排除二氧化碳；③確保以CO2和HCO3-為催化底物的酶保持適度的底物濃度，參與體內酸堿平衡調節及離子交換等過程起重要的作用；碳酸酐酶是紅細胞的主要蛋白質成分之一，在紅細胞中的地位僅次于血紅蛋白；本實驗結果分析發現，存在有兩種形式碳酸脫水酶同工酶，根據肽段的匹配更接近與碳酸酐酶Ⅲ（CAⅢ）的結構，CAⅢ肽鏈均由259個氨基酸組成；就目前的了解，CAⅢ除上述功能外，可能存在的生理作用主要有3點：①由于CAⅢ具有水化酶的功能，因此可以促進將I型肌纖維代謝過程中產生的CO2運送出細胞；②由于CAⅢ具有磷酸酶活性，它可能參與細胞內的信號轉導；③由于肝臟，脂肪細胞和骨骼肌的功能均與能量代謝有關。研究還發現，在重癥肌無力患者的骨骼肌上測得CAⅢ蛋白的表達水平明顯減少[4]。對于重癥肌無力骨骼肌中CAⅢ蛋白缺乏的認識，其可能與骨骼肌的易疲勞和收縮無力有關[5]。本研究結果分析，CAⅢ均在非萎縮組及萎縮組都明顯的升高，當在copd患者中，推測原因有兩種，①由于CO2的儲留引起碳酸的升高，故體內的PH降低，機體為調解體內的酸堿平衡，促進CAⅢ的生成來維持機體的酸堿平衡，促進CO2排除細胞外而維持體內酸堿平衡；②由于患者的運動耐力減弱、骨骼肌收縮力減弱，機體為增加肌肉收縮力而對CAⅢ增加的調節，來抵抗肌力的下降；這一點與上述理論是相吻合的，另外CAⅢ還具有磷酸酶的活性，磷酸酶是細胞信號傳到的一種重要的酶，故CAⅢ是否在信號傳導上存在對骨骼肌的調節？是否還參與copd患者外周骨骼肌蛋白的分解等的作用分子機制還有待進一步研究。

3.3肌鈣蛋白T（TnT） 肌鈣蛋白位于肌纖維之中，是橫紋肌收縮的重要調節蛋白，是調節Ca2+的可逆作為肌肉收縮離合開關。肌鈣蛋白T（TnT）是肌鈣蛋白其中1個亞基，在骨骼肌收縮和舒張過程中起重要調節作用，與原肌球蛋白結合，是肌肉的主要調節蛋白；本實驗研究慢肌中的肌鈣蛋白T同工型在非萎縮組和萎縮組均有明顯的升高，但在后期發生骨骼肌萎縮時，肌鈣蛋白T有所下降，但還高于正常組，根據以上的理論與實驗結果綜合分析認為在copd初期未發展到骨骼肌萎縮時，骨骼肌收縮與舒張較正常下降，機體為抵抗骨骼肌功能的減弱，增加肌鈣蛋白T同工型來結合鈣離子增加粗肌絲與細肌絲的運動，增加骨骼肌的運動耐力，維持正常運動。推測copd患者缺氧逐漸加重、病情逐漸發展，合成ATP進一步的減少，甚至發展到合成ATP不足，引起骨骼肌蛋白的分解來彌補供能的不足，即骨骼肌纖維的減少，發生萎縮，故肌鈣蛋白T較前有所下降；但在研究肌鈣蛋白T在骨骼肌上的很少，是否也存在骨骼肌的壞死、降解等機制仍不清楚，其分子機制還待進一步的研究。

總之，目前工作證明了使用蛋白質組學分析骨骼肌萎縮相關蛋白質的可行性和有效性。本研究方法及結果將給人的骨骼肌肌肉萎縮原因帶來的可能理解，并能對臨床診斷或者藥物發現的潛在目的，篩選一些\"疾病特異蛋白\"提供幫助。

參考文獻：

[1]Sousa L P，Brasil B S，Silva BdeM，et al.Characterization of alpha-enolase as an interferon alpha alpha 1 regulated gene [J].Front Biosci，2012，10 （5）：2534-2547.

[2]Ghosh A K，Steele R，Ray R B.C2myc p romoter binding p rotein1（MBP-1） regulates p rostate cancer cell growth by inhibitingMAPK pathway[J].JBiol Chem，2005，280（14）：14325-14330.

[3] Lopez Alemany R，SuelvesM，Diaz Ramos A，et al.Alpha-enolase plasminogen recep tor in myogenesis [J].Front Biosci，2005，10（1）：30-36.

[4]都愛蓮，任惠民，呂傳真，等.P25蛋白在重癥肌無力患者中的低表達及組織和種屬特異性的研究[J].中華醫學雜志，2004，84：103-106.

[5]涂江龍，任惠民，呂傳真，等.重癥肌無力患者骨骼肌中碳酸酐酶Ⅲ蛋白減少的原因[J].中華神經科雜志，2007，40：207-211.編輯/哈濤