PED相關糞腸球菌生物膜中胞外DNA作用的研究

摘要：目的 就PED相關糞腸球菌生物膜中胞外DNA作用進行研究。方法 選擇根管治療術失敗或者被診斷為頑固性根尖周炎的單根管牙，并且提取根管內糞腸球菌，鑒定糞腸球菌，制備糞腸球菌菌液，配制核酸染液。結果 實驗組在培養24h后基本都沒有菌胞附著，而對照組卻出現了較為密集的成熟生物膜結構。在PED相關糞腸球菌生物膜的形成過程中，胞外DNA會發揮出極為重要的作用。結論 胞外DNA能夠成為攻克PED相關糞腸球菌生物膜的新靶點，具有極為突出的作用效果。

關鍵詞：PED相關；糞腸球菌生物膜；胞外DNA；作用

根管生物膜的存在是導致根管治療術失敗，以及根尖感染性疾病、牙髓感染性疾病經久不愈的主要原因，而糞腸球菌則是主要導致根管內感染治療失敗的致病菌。生物膜會讓糞腸球菌長期生存于高抗菌藥性、高堿性、營養物質缺乏的惡劣環境中，并且還會出現再感染的問題[1]。實驗表明：PED相關糞腸球菌生物膜中胞外DNA作用極為有效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1菌株和試劑 糞腸球菌、BhI液體培養基、吖啶橙、ClED培養基、溴化已錠（EB）、DNASEI。

1.2方法

1.2.1提取根管內糞腸球菌 選擇根管治療術失敗或者被診斷為頑固性根尖周炎的單根管牙。牙體髓室和表面用碘伏（20g/l）進行消毒，在根管內插入標準紙捻，在根尖孔處停留10s。然后將紙捻取出，立即浸入到移液管中（盛有琉基乙醇酸鹽轉送液，劑量為1.0ml），浸泡30min后送檢。再用漩渦振蕩器振蕩1min移液管，將全部樣本的劑量都調整到300μl，離心10min。再用PBS稀釋，震蕩混勻。在ClED鑒定培養基上接種50μl，放置在溫度為37℃的環境內培養18h。

1.2.2鑒定糞腸球菌 細菌學鑒定：基于ClED鑒定培養基上菌落的顏色和形態來鑒定是否為糞腸球菌，假定直徑約0.5mm、顏色的黃色的菌落為糞腸球菌。

生化反應：65g/l氯化鈉肉湯、膽汁七葉苷、阿拉伯糖、甘露醇均為陽性；山梨糖、觸酶均為陰性。在BhI瓊脂培養基中接種菌株，保存溫度為-4℃。

1.2.3制備糞腸球菌菌液 將單菌從BhI瓊脂培養基（已分離純化）取出，在BhI液體培養基中接種，并且放置在設定溫度為37℃的恒溫培養箱中常規培養24h，離心10min，離心速度為4000r/min。洗菌2次，再加入無菌的BhI液體培養基來配制成菌液（OD600=0.6）。取2ml菌液放置于試管中，基于NCClS標準方法來合理配制，在30min內完成，將配制好的菌液接種。

1.2.4配制核酸染液 取1mg溴化已錠、1mg吖啶橙溶于PBS溶液（Ph值為7.0，劑量10ml），配制成儲備液（濃度為100μg/ml），等份混合EB儲備液及吖啶橙稀釋成工作液。

1.3 DNASEI對糞腸球菌生物膜形成的影響 將一個滅菌的蓋玻片（規格為20mm×20mm）放入細胞培養皿（直徑35mm）內，取1ml無菌BhI培養液及1ml菌液混合后滴至蓋玻片表面。對照組加入2ml的BhI培養液，實驗組加入2ml的DNASEI（濃度為100U/ml）。封閉方式選用封口膜，放入37℃恒溫箱常規培養。在培養24h再取出，將封口膜開啟，吸凈液體。為了能夠將表面浮游細菌去除，可再用1mlPBS洗滌2次，然后再將200μl核酸染液滴加到生物膜表面，然后黑暗室溫孵育2min以便進行ClSm觀察。

1.4 DNASEI對自由生長至不同時段的生物膜的影響 在6孔培養板中放入蓋玻片（規格為20mm×20mm），取1mlBhI培養液和1ml標準菌液進行混合，而后滴至蓋玻片表面，封閉封口膜，37℃培養6個時段（分別是48h、36h、24h、18h、12h、6h）。

1.5定量分析紅綠熒光 生物膜全部區域的各個層面都用ClSm予以逐次掃描，對紅綠光面積進行分別統計，進而對生物膜活性予以計算。生物膜活性=綠熒光量/綠熒光量+紅熒光量。

2 結果

2.1 DNASEI對糞腸球菌生物膜形成的影響 實驗組在培養24h后基本都沒有菌胞附著，而對照組卻出現了較為密集的成熟生物膜結構。

2.2 DNASEI對自由生長至不同時段的生物膜的影響 根管內糞腸球菌生物膜的生長活性在各個階段都被DNASEI明顯降低，與對照組存在著較為明顯的差異，具有統計學意義（P<0.05），生物膜中胞外DNA隨著生物膜的生長而增多；由此可見，在PED相關糞腸球菌生物膜的形成過程中，胞外DNA會發揮出極為重要的作用。

3 討論

本研究采用溴化已錠（EB）染色劑作為胞外DNA的染色劑，溴化已錠的靈敏性較高，在檢測DNA中常被使用。EB雖然不能將檢測DNA直接穿過，但是卻含有一個與堿基位置接近的平面基團，使得DNA與染料結合，并呈現出較為明顯的熒光。共聚焦顯微技術既可定位細胞內熒光，又能夠定量分析細胞內熒光，，獲得分布在樣品不同部位的熒光強度數值及變化情況。

本研究對PED相關糞腸球菌生物膜中胞外DNA作用進行探討過程中，利用了生物制劑DNaseI，DNaseI是一種特異性DNA水解酶。將DNaseI放置在培養皿中24h后，卻基本沒有菌落出現在玻片上，而24h生物膜卻出現在沒有放置DNaseI的玻片上，這充分說明：胞外DNA與PED相關糞腸球菌生物膜的形成密切相關[2-3]。而實驗表明：早期生物膜的繼續形成可被DNaseI成功抑制，能夠明顯分解已成熟的生物膜，這充分說明：胞外DNA對PED相關糞腸球菌生物膜成熟后的擴散增厚都有著極為重要的意義?？傊?，胞外DNA能夠成為攻克PED相關糞腸球菌生物膜的新靶點，具有極為突出的作用效果。

參考文獻：

[1]古麗莎，凌均棨.根管生物膜及其臨床控制的研究進展[J].國際口腔醫學雜志，2006，33（5）：349-351.

[2]文靜，范兵.根管內糞腸球菌感染的研究進展[J].國際口腔醫學雜志，2007，34（1）：13-15.

[3]倪玉華，張建軍，孫寶貴.DNA酶Ⅰ的研究進展[J].國際病理科學與臨床雜志，2006，26（6）：531-535.編輯/金昊天