加味五皮飲對OHSS模型大鼠E2、IL—6和VEGF的實驗研究

摘要：目的 觀察加味五皮飲是否能夠抑制OHSS模型大鼠外周血清IL-6和E2水平，能否降低OHSS模型大鼠卵巢重量、VEGF蛋白在卵巢上表達水平，從而對OHSS的發生起到防治作用。方法 選用未成年雌性Wistar大鼠30只，隨機分成模型中藥組、模型對照組每組15只。將兩組未成年雌性Wistar大鼠采用PMSG+hCG方式建立OHSS模型，同時給予加味五皮飲和生理鹽水灌胃。HCG注射48h后，沿腹部中線切開腹腔，取出大鼠雙側卵巢稱重，采用免疫組化對大鼠卵巢組織VEGF蛋白表達的測定；分別用ELISA和RIA檢測血清中IL-6和E2水平。結果 模型中藥組卵巢重量、卵巢VEGF蛋白表達、血清E2和IL-6水平與模型對照組比較有統計學差異（P<0.01）。結論 加味五皮飲可以降低OHSS大鼠卵巢的重量、外周血IL-6、E2水平、卵巢組織中VEGF的表達。

關鍵詞：卵巢過度刺激綜合征；血管內皮生長因子；雌二醇；白介素6

卵巢過度刺激綜合征是一種在排卵誘導治療導致的醫源性并發癥，在接受輔助生殖治療時最為常見，嚴重的OHSS可危及生命。嚴重OHSS的臨床特點包括卵巢腫大、腹脹、腹水、惡心、嘔吐、電解質紊亂、低血容量、少尿、腎功能衰竭、胸腔積液、血液濃縮、血栓栓塞現象（腦血管疾病和心肌梗死），甚至死亡。由于輔助生殖技術的高速發展和推廣，輔助生殖治療不孕不育的需求不斷增加。有報道稱，OHSS所有類型的發病率從1%到高達23%的范圍內是高度變化的，并且在所有治療周期中的嚴重類型的發病率高達5%，特別是在發展中國家[1]。隨著對OHSS研究的深入，其發病機制以及病理表現得以充分闡述，但仍然未完全清楚。本研究通過對OHSS模型大鼠造模同時給予中藥干預，來觀察其療效，為臨床上防治奠定基礎。

1 資料與方法

1.1實驗動物 選用未成年雌性Wistar大鼠（SPF級）30只，22d齡，體重平均（49.2±4.5）g，購于長沙東創實驗動物科技服務部。大鼠飼養于相同環境，自由攝水飲食，室溫20℃～22℃，相對濕度為40%～60%。

1.2實驗分組 按體質量大小編號，根據隨機數字表將30只雌性Wistar大鼠，隨機共分為兩組：模型中藥組、模型對照組，每組15只。

1.3主要試劑與儀器 免疫組化一抗試劑，購于美國Santa Cruz公司；PV-9000試劑與DAB顯色劑，購于北京中杉金橋； 白介素6檢測試劑盒， 購于武漢優爾生；雌二醇放免測定盒，購于北京華英生物技術研究所。酶標儀（丹麥RAYTO公司）；722型可見光分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；r-911全自動放免計數儀（中國科技大學實業總公司）；高倍光學顯微（德國LEICA公司）。

1.4方法

1.4.1 OHSS大鼠模型建立 按改良的Ujioka方法[2]對30只未成年雌性Wistar大鼠建立OHSS模型。每只大鼠從22～25d齡連續 4d皮下注射含有10IU PMSG的生理鹽水0.1ml，1次/d；26日齡（最后一次注射 PMSG后24h）皮下注射含有100IU hCG生理鹽水0.1ml 1次。注射用人絨毛膜促性腺激素1000IU/支，妊娠雌馬血清促性腺激素1000IU/支。

1.4.2中藥及給藥劑量 根據補腎健脾活血利濕法，以《華氏中藏經》中五皮飲為基礎方進行加味擬方，具體中藥飲片如下：陳皮、茯苓皮、生姜皮、桑白皮、大腹皮各20g、菟絲子15g、桑寄生15g、黃芪12g、白術12g、當歸10、黨參12g，以上藥物用水浸泡30min，加熱沸騰后小火微沸30min，過濾，使生藥含量為1g/ml水煎劑。于造模同時，模型中藥組、模型對照組分別予以加味五皮飲和生理鹽水2ml灌胃進行干預，1次/d，連用7d。按動物體表面積比率換算等效劑量，公式：大鼠劑量（g）=人用劑量（g）×0.018×5。得出加味五皮飲給藥劑量為：1.575g/100g/d。

1.4.3標本采集 HCG注射48h后即28d齡時，肌肉注射用苯巴比妥鈉（80mg/kg） 麻醉30只OHSS模型大鼠，20min后股靜脈采血2ml于試管中，待血液標本凝固后，離心（3000r/min、10min）吸取血清-20℃保存備檢；沿腹部正中線切開大鼠腹腔，取出卵巢組織并稱重，脫頸處死大鼠，放入裝有福爾馬林的PE管內固定，常規石蠟包埋，4μm連續切片，用于免疫組化染色。

1.4.4指標測定 血清中E2測定用放射免疫法檢測，IL-6測定采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定。卵巢中VEGF蛋白測定采用免疫組化PV二步法，應用MIQAS醫學圖象定量分析系統進行定量分析，每張切片在高倍鏡下隨機選5個有意義的視野，在同等條件下測量VEGF的陽性光密度值，取平均值為該切片的光密度值，同時測量陽性面積，并計算出陽性面積比（陽性面積/總面積），最后導入公式中計算出免疫組化陽性指數。免疫組化陽性指數=陽性面積比×平均光密度值。陽性指數越大，陽性表達越高。

1.5統計分析 采用 SPSS13.0 統計學軟件對所得數據進行統計分析，計量資料采用均數土標準差（x±s）來表示；計量資料采用兩獨立樣本的t檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05提示有統計學意義。

2 結果

2.1大鼠卵巢重量 肉眼觀察下模型中藥組、模型對照組的OHSS模型wistar大鼠雙側卵巢明顯增大，呈多囊改變，可見多個卵泡。模型中藥組與模型對照組比較有統計學差異（P<0.01），模型中藥組大鼠雙側卵巢重量低于模型對照組。見表1。

2.2 LI-6與E2含量 采用EILSA檢測方法，于酶標儀450nm波長處讀取各空OD值，計算出標準曲線為：y=27.72x2-118.57x+67.283，R2=0.9872。各組大鼠血清中IL6的含量結果，統計分析后得出，模型對照組與模型中藥組比較有顯著統計學差異（P<0.01），模型中藥組大鼠血清中IL6含量要低于模型對照組。采用放射免疫法檢測方法，檢測各組大鼠血清中E2的含量結果進統計分析得出，模型對照組與模型中藥組比較有統計學差異（P<0.01），模型中藥組大鼠血清中E2含量要低于模型對照組。見表2。

2.3大鼠卵巢VEGF檢測結果 各組大鼠卵巢組織中VEGF在黃體細胞、卵泡顆粒細胞胞漿中均有表達，呈黃色，應用MIQAS醫學圖象定量分析系統，對兩組大鼠卵巢組織圖像進行分析，測量免疫組化圖像中陽性區域面積比以及光密度值，計算出免疫組化陽性指數，通過統計得出結果為：模型對照組與模型中藥組比有統計學差異（P<0.01），模型中藥組組免疫組化陽性指數要低于模型對照組，見表3。

3 討論

OHSS主要是由于卵巢在促性腺激素的刺激下，卵巢過度刺激導致血管活性物質增多，導致多個臟器功能障礙一種全身性疾病。卵巢過度刺激后所表現的主要特點為：大量的卵泡產生、血清中雌二醇的水平身高以及卵巢體積增大。導致該綜合征出現的發病機制主要是，血管通透性增高，血管內液體滲出增多，血管內血液濃縮從而降低了組織器官的灌流量；同樣，血液在血管內呈凝固趨勢，提高了血栓形成以及血栓栓塞的概率，并且過度的滲出液將導致組織間隙的水腫，引起胸腹腔積液，甚至是肺水腫。hCG的應用不僅是誘發卵母細胞成熟關鍵的一步，同樣也是在控制性超排卵后，誘發OHSS發生的先決條件[3]。因為使用hCG可以誘導多個卵泡和黃體的形成，顆粒細胞中的VEGF mRNA水平增高，從而產生大量的VEGF，表達在卵巢中，引起血管通透性增加[4-6]。通過與血管內皮生長因子受體2（VEGFR-2），血管內皮生長因子刺激新血管的產生并且使血管通透性升高[7-9]。在OHSS的發病機制中除了由VEGF介導的卵泡血管生成和毛細血管通透性升高外，還有包括免疫系統和腎素-血管緊張素系統RAS[10，11]。

雌二醇與OHSS的發生有著密切的關系，據報道在大多數預測OHSS發生的方法中，檢測血清中E2是最重要的一項指標[12]。Asch等[13]通過臨床對OHSS發病率的研究中發現，如IVF-ET患者血清E2 水平在>6000IU/ L 和3500～5999IU之間時，OHSS的發生機率分別是38%、1.5%，低于3500IU/ L時，未出現1例OHSS的發生。有研究指出，在月經周期第9d時血清中E2>800pg/ml時，發生OHSS的風險將會升高[14]。Arianna等[15]研究發現在卵巢刺激的第11d，婦女血清中E2含量為3354pg/ml時，發展為OHSS的風險將高達85%。當血清中E2水平在最初的2～3中加倍升高，且高達3000pg/ml并且出現多個卵泡快速增長時，提示要進行干預，謹防發生OHSS。Navot 等[16]指出，應用HCG出現血清中E2急劇上升并且卵巢中出現30個以上的卵泡，將提示重度OHSS的發生。盡管血清中E2 過高導致OHSS發生確切機制不明確，但是與雌激素的生物學效能有一定的關系，它具有增強肝臟合成血管緊張素（AT）、擴張血管、促使水鈉儲留并可的作用，雌激素水平增高的同時也會引起了體內一些細胞因子的升高，因此低水平的E2 能夠有效的防止OHSS的發生[17-19]。

祖國醫學無OHSS的相關記載記載， 但通過臨床癥狀如卵巢增大、胸腹腔積液、全身水腫等體征，可結合中醫學中子腫、臌脹、癥瘕等范疇。根據中醫理論，認為其病變涉及肺、脾、肝、腎等臟腑。五皮飲方由生姜皮、桑白皮、大腹皮、茯苓皮、廣陳皮五種藥物組成。方中以茯苓皮利水滲濕，兼以補脾助運化；生姜皮散水飲；桑白皮肅將肺氣，以通調水道；大腹皮行水氣，消脹滿；陳橘皮和胃氣，化濕濁五藥相合，在本方基礎上加以菟絲子、桑寄生、黃芪、白術、當歸、黨參，從而能夠達共奏理氣健脾，利濕消腫之效。

在研究結果中可以發現加味五皮飲能夠減輕卵巢重量并且有效的抑制OHSS模型大鼠血清中E2、IL-6水平及降低VEGF蛋白在卵巢表達。通過本次研究為臨床上防治OHSS奠定了理論基礎。

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編輯/哈濤