SPE和HPLC對微生物降解體系中十溴聯苯醚含量的測定

摘要：采用固相萃取法提取菌GH10降解體系中的十溴聯苯醚（BDE-209），高效液相色譜法測定十溴聯苯醚的含量，并對各種試驗條件進行了優化。結果表明，固相萃取的最佳洗脫劑為正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V），最佳洗脫體積為4 mL（2 mL×2）；高效液相色譜法的最佳檢測條件：檢測波長為260 nm，柱溫箱溫度為30 ℃，流動相為乙腈∶水（95∶5，V/V），流動相流速為1.2 mL/min，在此條件下 BDE-209的出峰時間為24.705 min；菌GH10在3 d內能夠快速降解高濃度BDE-209（50 mg/L），第3天的降解率達到最高為59.24%。通過固相萃取法和高效液相色譜法能夠快速提取和檢測微生物降解體系中的十溴聯苯醚，該方法操作簡單，節省時間。

關鍵詞：十溴聯苯醚（BDE-209）；固相萃取法（SPE）；高效液相色譜法（HPLC）；菌GH10；降解率

中圖分類號：O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1198-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.043

Abstract： In Solid-phase extraction was used to extract BDE-209 in the GH10 degradation system. The concentration of BDE-209 was detected by HPLC. The conditions of solid-phase extraction and HPLC were optimized. For solid-phase extraction， the optimal eluent solvent was hexane/dichloromethane （1∶1，V/V）， with volume of 4 mL （2 mL×2）. For HPLC， the detection wavelength and temperature of the oven was 260 nm and 30 ℃. The optimal mobile phase was acetonitrile/water （95∶5，V/V）， with the flow rate of 1.2 mL/min. The retention time of BDE-209 was 24.705 minutes. GH10 strains efficiently degraded BDE-209（50 mg/L） in three days. The degradation rate was up to 59.24% by the third day. The method of using solid-phase extraction and HPLC can quickly extract and detect BDE-209 in the microbial degradation system. It is simple and time saving.

Key words： BDE-209； solid-phase extraction； HPLC； GH10 strain； degradation rate

多溴聯苯醚（PBDEs）是一類高效添加型溴系阻燃劑，被廣泛應用于各種電子、電器、紡織、建材等產品中[1，2]。而這些產品在大量生產、使用和廢棄的過程中，均不同程度地使PBDEs進入各種環境介質當中，甚至在人的毛發和母乳中都能檢測到[3-6]。據研究表明，PBDEs具有致癌性及內分泌干擾毒性[7-12]，因此環境中的PBDEs嚴重威脅人類健康及生態安全。

多溴聯苯醚中的十溴聯苯醚（BDE-209）因其具有溴化程度高，阻燃性能好，價格低等優點，所以是使用最多的一種PBDEs[13，14]。目前，環境樣品和生物樣品中BDE-209的提取方法主要有索氏提取、液液萃取、超聲波輔助萃取和固相萃取（SPE）等方法[15-17]。相比于其他方法，固相萃取具有耗時短、消耗溶劑少、操作簡便等優點，可以高效提取樣品中的BDE-209。BDE-209的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS），其中GC-MS的離子源多采用NCI源[18]，而采用EI源的GC-MS不能檢測高溴代聯苯醚，例如BDE-209。

本研究采用微生物法對BDE-209進行降解，并采用固相萃取法（C18固相萃取小柱）和HPLC法對降解體系中的BDE-209進行提取和檢測。試驗過程中對HPLC的檢測條件進行了優化，同時考察了不同溶劑對BDE-209的萃取效率，為水相中高濃度BDE-209的提取和檢測提供一定的理論依據及基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 二甲亞砜（AR級），二氯甲烷（AR級），正己烷（AR級），四氫呋喃（AR級），甲醇（HPLC級），乙腈（HPLC級），均購自上海凌峰化學試劑有限公司；BDE-209（純度99%，百靈威科技有限公司）。BDE-209儲備液：以二甲亞砜為溶劑配成濃度為1 000 mg/L的BDE-209儲備液。BDE-209標準溶液：以二甲亞砜為溶劑將BDE-209儲備液稀釋成濃度為100 mg/L的BDE-209標準溶液。將無水硫酸鈉置于馬弗爐中于450 ℃下烘4 h以上，稍冷后放入干燥器中冷卻，密封保存，備用。

1.1.2 培養基 ①LB液體培養基：魚粉蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、去離子水1 000 mL，pH 7.0。②LB固體培養基：向LB液體培養基中加入2%的瓊脂即可。③無機鹽培養基（MSM）：KH2PO4 2.65 g、Na2HPO4 4.26 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2·2H2O 0.02 g、FeSO4·7H2O 0.014 g、NH4Cl 0.5 g、微量元素 1 mL；去離子水1 000 mL，pH 7.0。其中微量元素溶液組成為： FeSO4·7H2O 2.1 g、 ZnCl2 0.07 g、 CuSO4·5H2O 0.03 g、 MnSO4·H2O 0.06 g、 CoCl2·6H2O 0.19 g、（NH4）6Mo7O24 ·4H2O 0.024 g、 去離子水1 000 mL。

1.1.3 菌株來源 試驗中所用的長野雷夫松氏菌（Leifsonia shinshuensis，簡稱菌GH10）系趙曉祥課題組篩選獲得的能夠降解高濃度BDE-209的純菌，其最佳生長條件為30 ℃，pH 7.0，搖床轉速150 r/min。

1.1.4 加標樣品 以BDE-209濃度為50 mg/L的無機鹽培養基作為固相萃取的加標樣品，無機鹽培養基中接入8%滅活的菌GH10。

1.1.5 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），配色譜柱（Inertsil ODS-3 C18，5 μm，250 mm×4.6 mm，日本島津公司）；TSBEQ-CR1012型固相萃取儀（上海Anpel科學儀器有限公司），固相萃取小柱C18柱（HC-C18，200 mg/3 mL，上海Anpel科學儀器有限公司）；PYX-DHS-400-BS型隔水式電熱恒溫培養箱（上海博泰實驗設備有限公司）；SPH-2102C型立式雙層搖床（上海世平儀器設備有限公司）；TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化及菌懸液的制備 取1環保藏于甘油中的菌GH10并直接在LB固體培養基上劃線培養3 d，然后挑取單菌落再一次劃線培養3 d，一共活化2次。最后挑取單菌落于LB培養基中培養48 h，此時菌GH10處于對數期，然后取適量菌液于6 000 r/min離心6 min，收集菌體并用生理鹽水洗滌菌體3次，以等體積的生理鹽水重懸，即得菌懸液。

1.2.2 高效液相色譜條件優化 采用HPLC法對BDE-209（以四氫呋喃為溶劑）的檢測條件進行優化，手動進樣，進樣量為20 μL。①檢測波長的選擇。通過對BDE-209進行紫外掃描，確定BDE-209的HPLC檢測波長；②流動相比例及流速的選擇。依次選用甲醇-去離子水、乙腈-去離子水為流動相，比較兩種洗脫劑在不同配比的情況下BDE-209的色譜行為；選擇好流動相后，改變流速以確定BDE-209的出峰時間。

1.2.3 固相萃取條件優化 ①洗脫劑種類的選擇。BDE-209介于非極性和極性之間，根據相似相溶原理，選擇從非極性到極性5 種不同的洗脫劑，即正己烷、正己烷/二氯甲烷（8∶2，V/V）、正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V）、正己烷/二氯甲烷（2∶8，V/V）、二氯甲烷。BDE-209的固相萃取過程為：先用2 mL二氯甲烷預洗C18固相萃取小柱，于負壓下抽干溶劑，再依次用3 mL甲醇和3 mL去離子水活化，活化過程要保持小柱床體材料濕潤；然后將2 mL加標樣品進行上樣，之后用3 mL去離子水淋洗以去除吸附在床體的雜質，并于負壓下抽真空，直至C18小柱床體材料完全干燥；最后采用2、2、1 mL （共5 mL）不同極性的洗脫劑依次對目標化合物BDE-209進行洗脫，收集洗脫液。最終洗脫液過無水硫酸鈉去除水，經0.22 μm有機濾膜過濾后進樣檢測。每種洗脫劑進行3次平行試驗，重復2次。②洗脫劑體積的選擇。分別用2、2、1 mL正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V）對BDE-209進行3次洗脫，并分別收集洗脫液，依次編號，分別計算各洗脫液的絕對回收率及洗脫率。進行3次平行試驗。

1.2.4 菌GH10對BDE-209的降解 于250 mL錐形瓶中加入5 mL BDE-209標準儲備液，使得體系中BDE-209的濃度為50 mg/L。待二甲亞砜揮發后，加入無機鹽培養基92 mL，121 ℃下高壓滅菌25 min。待培養基冷卻到室溫，接入GH10菌懸液，接種量為8%。30℃、150 r/min搖床避光降解培養5 d，每天各取樣1次，每次取樣2 mL，用2×2 mL二氯甲烷/正己烷（1∶1，V/V）對培養基中殘余的BDE-209進行洗脫，合并洗脫液后立即進行HPLC檢測。以接入滅活的菌懸液的無機鹽培養基為空白對照，每一處理設3個平行，重復2次。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件優化

2.1.1 檢測波長的選擇 BDE-209的紫外掃描光譜曲線如圖1所示。從圖1中可以看出，在260 ～ 280 nm內，BDE-209對紫外光都有較好的吸收。據研究，BDE-209的HPLC的檢測波長多選擇226 nm和260 nm[19]，本研究最終確定其檢測波長為260 nm。

2.1.2 柱溫的選擇 色譜柱的溫度直接影響樣品的分離效果，由于BDE-209的紫外吸收較強，且較易洗脫，所以對溫度的要求不太苛刻，因此本研究控制色譜柱的溫度為30 ℃。

2.1.3 流動相的選擇 當采用以乙腈/水（95∶10，V/V）為流動相，流速為1.0 mL/min時，在56.25 min出現明顯的BDE-209色譜峰，但保留時間較長。增加有機相比例，即乙腈/水（95∶5，V/V），流速為1.0 mL/min時，BDE-209的出峰時間提前到31.360 min。在相同流速下，流動相改為甲醇/水（V/V）時，BDE-209出峰時間延遲到44.86 min。繼續增加有機相比例，即乙腈∶水（97∶3， V/V）為 ，流速保持為1.0 mL/min時，BDE-209的出峰時間提前到23.300 min，但是峰的前段發生傾斜，且整個峰型不對稱。當有機相比例保持在乙腈：水（95∶5，V/V） 流速提高到1.2 mL/min時，BDE-209的出峰時間提前到24.705 min，而且峰型沒有發生變化。試驗結果表明，與甲醇/水體系相比，采用乙腈/水體系作為流動相，可以縮短BDE-209的出峰時間；流速從1.0 mL/min升高到1.2 mL/min，不僅可以縮短出峰時間，而且還可以保證色譜峰的峰型。本研究最終選擇乙腈/水（ 95∶5，V/V）體系作為流動相，且乙腈/水流速為1.2 mL/min，可以保證樣品中的各成分有效分離，且色譜峰的峰型也較好，BDE-209的保留時間為24.705 min，BDE-209的HPLC色譜圖如圖2所示。

2.2 BDE-209標準曲線

采用外標法定量。準確量取一定量的BDE-209標準溶液，用二甲基亞砜配制成濃度為5、10、15、20、30、40、50、60 mg/L的BDE-209溶液。采用HPLC法分別測定各個濃度的BDE-209溶液，將測得的各濃度溶液相對應的峰面積（y）隨BDE-209濃度（x）作圖，建立BDE-209校準曲線，如圖3所示。從圖3中可以看出，BDE-209在0～60 mg/L內線性關系良好，R2為0.999 7。標準曲線方程為y=15.662x-1.954 2。

2.3 固相萃取條件優化

2.3.1 洗脫劑種類的選擇 經過正己烷、正己烷/二氯甲烷（8∶2，V/V）、正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V）、正己烷/二氯甲烷（2∶8，V/V）、二氯甲烷這5種不同極性的洗脫劑對BDE-209進行洗脫，其洗脫效果見表1，從表1中可看出，正己烷對BDE-209的洗脫效果最差，而其余4種洗脫劑均能較好地洗脫BDE-209，其中正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V）對BDE-209的洗脫其回收率為99.61%，基本能夠完全洗脫BDE-209，選擇正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V）作為BDE-209的洗脫劑。

2.3.2 洗脫劑體積的選擇 依次用2、2、1 mL正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V）對吸附在固相萃取柱中的BDE-209進行洗脫，其洗脫效果見圖4。由圖4可見，目標化合物BDE-209主要隨第一個2 mL洗脫液a流出，95.42%的BDE-209被洗脫掉，而洗脫液b中僅含有微量的BDE-209，洗脫液c中已無目標化合物BDE-209的流出。因此體積為2 mL×2的洗脫液已能將BDE-209全部洗脫。

2.4 菌GH10對BDE-209的降解

經過5 d的降解，在上述優化后的HPLC條件和固相萃取條件下，對微生物體系中的BDE-209殘留量進行測定，結果見圖5。從圖5中可看出試驗的前3 d培養液中的BDE-209被菌GH10快速降解消耗；第1天培養液中BDE-209的濃度為40.93 mg/L，降解率比較低，這主要是因為第1天微生物處在一個適應環境的狀態；第2天和第3天培養液中BDE-209的濃度迅速降低，并且在第3天時培養液中BDE-209的濃度最低，為20.38 mg/L，此時BDE-209的降解率達到最高，為59.24%；第4 天和第5天，培養液中的BDE-209的濃度略微有些升高，可能是部分菌GH10死亡使得體內未被分解的BDE-209釋放到培養液中導致的。因此，采用HPLC法和固相萃取法，能夠高效檢測微生物體系中BDE-209的含量，同時可知菌GH10在3 d內能夠快速降解BDE-209。

3 小結與討論

3.1 高效液相色譜條件優化結果

BDE-209的高效液相色譜檢測條件為：①根據BDE-209的紫外掃描光譜曲線，確定BDE-209的檢測波長為260 nm；②BDE-209的紫外吸收較強，并且比較容易從色譜柱上洗脫下來，因此溫度對BDE-209 的檢測影響不大，選擇30 ℃作為BDE-209的檢測溫度；③流動相種類、比例和流速均能影響BDE-209的出峰時間和峰形，當流動相為乙腈/水（95∶5，V/V=）以及流速為1.2 mL/min時， BDE-209不僅能夠提前出峰，而且峰形也比較好，其出峰時間為24.705 min。

3.2 固相萃取條件優化結果

BDE-209是一種介于中等極性的有機物，因此與BDE-209極性相似的洗脫劑能夠完全將其從固相萃取柱中洗脫出來，BDE-209的最佳洗脫劑為正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V），最佳洗脫體積為4 mL（2 mL×2），洗脫回收率為99.61%，RSD為2.84%。

3.3 菌GH10對BDE-209的降解效果

菌GH10是一種能夠有效降解高濃度BDE-209的微生物，經過5 d的培養， BDE-209被菌GH10降解。采用固相萃取和高效液相色譜法對該降解體系中的BDE-209進行提取和檢測，第3天降解體系中BDE-209的殘留濃度最低，降解率為59.24%；第4天和第5天菌GH10部分死亡使得菌體內未被分解的BDE-209釋放到培養液中，導致體系中BDE-209的濃度略有上升。通過固相萃取和高效液相色譜法能夠快速提取和檢測微生物降解體系中BDE-209的含量，對水相中BDE-209的檢測提供一些實踐基礎和理論意義。

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